纯棉织物上黑曲霉胞内ATP提取方法探索

王志惠, 谭玉静, 杨雪霞, 赵曙辉

(1. 东华大学 化学化工与生物工程学院, 上海 201620;2. 上海市质量监督检验技术研究院, 上海 200040)

纯棉织物上黑曲霉胞内ATP提取方法探索

王志惠1, 谭玉静2, 杨雪霞1, 赵曙辉1

(1. 东华大学 化学化工与生物工程学院, 上海 201620;2. 上海市质量监督检验技术研究院, 上海 200040)

细胞内三磷酸腺苷(ATP)的有效提取是利用ATP发光法检测微生物数量的关键.为判断霉菌在织物上的生长情况, 以纯棉织物上接种的黑曲霉为对象, 研究了霉菌胞内ATP的提取方法，对比了加热煮沸法、磷酸盐缓冲液法、三氯乙酸法、二甲基亚砜法和苯扎溴铵(BAC)法共5种ATP提取方法对黑曲霉胞内ATP的提取效率.研究结果表明， BAC法提取ATP效果最好；BAC法提取的适宜条件：BAC质量分数为0.50%, pH值为12.0, 提取时间为5 min.相比于传统的检测法, 通过测定ATP含量判断织物上霉菌生长的方法使检测效率显著提高.

纯棉织物； 黑曲霉； 三磷酸腺苷(ATP)； 生物发光法； 提取条件

近年来, 国内织物防霉整理技术发展迅速, 建立快速准确的纺织品防霉性能检测评价方法很有必要.现行的纺织品防霉性能评价方法主要是依据接种霉菌在试样表面的生长情况来评价, 培养时间为28 d, 培养结束后根据霉菌生长面积进行分级.该方法不仅周期长, 而且霉菌生长程度及生长面积很难准确判断, 实验结果存在一定的偏差[1].因此, 探索一种快速准确的织物防霉性能检测方法是非常必要的.

三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP) 是自然界各种生命活动中通用的能量载体, 是活细胞新陈代谢的一个指标, ATP的含量直接反映了细胞的数量和细胞代谢活力.ATP生物发光法是近年来开发出的一种通过检测细胞内ATP含量来反映微生物的生长情况或数量的方法.该方法的原理: 荧光素作为可被氧化的底物, 在镁离子存在的条件下, 与荧光素酶和ATP结合形成荧光素酶-荧光素-单磷酸腺苷(AMP)的复合物, 该复合物再与氧结合发出荧光[2-3].用方程式表达如下:

虫荧光素+AMP +CO2+光能

在一定浓度范围内, ATP的浓度与发光强度呈线性关系[4].ATP生物发光法具有简便、快速、高灵敏度等特点，已广泛应用于食品、医疗卫生、环境等领域的微生物检测[4].目前国外已将ATP生物发光法用于抗菌织物抗菌效果的评价[5], 我国尚未建立利用ATP发光法进行纺织品防霉整理的检测方法.

利用细胞内ATP含量进行微生物检测时, 细胞内ATP的提取是关键.自ATP生物发光法应用于微生物检测以来, 人们对微生物细胞内ATP提取方法进行了较多的探索，目前主要集中在细菌细胞, 对从霉菌细胞内提取ATP的方法研究较少.由于霉菌和细菌在细胞壁和细胞膜组成结构上差别较大, 有必要探索针对霉菌细胞内ATP的提取方法.据报道, 加热煮沸法、磷酸盐(PBS)缓冲液法[6]、二甲基亚砜(DMSO)法[7]、三氯乙酸(TCA)法和苯扎溴铵(BAC)法[8]均已应用于细菌ATP提取中.本文以在棉织物上接种的黑曲霉为对象, 选用上述5种方法评价ATP的提取效果, 为建立织物的防霉检测方法提供参考.

1　材料与方法

1.1材料及仪器

材料: 黑曲霉ATCC-6275,美国菌种保藏中心;国家标准贴衬织物(棉GB/T 7568.2—2008),上海市纺织工业技术监督所；ATP生物发光试剂盒(含ATP标准品),盖宁生物科技(北京)有限公司.

仪器：ATP快速检测仪,北京滨松光子技术股份有限公司.

1.2实验方法

1.2.1试剂配制

(1) 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(TE缓冲液):分别用去离子水配制10 mmol/L的Tris-HCl溶液和1 mmol/ L的EDTA, 调节pH值为8后等体积混合,121 ℃灭菌20 min.

(2) 沙氏液体培养基(SDB培养基):10 g/L胰蛋白胨, 20～40 g/L葡萄糖, pH值为5.6±0.2, 121 ℃灭菌20 min.

(3) PBS缓冲溶液:称取2.84 g磷酸氢二钠与1.36 g磷酸二氢钾,配制成1 L溶液, 并调节pH值为7.2～7.4,121 ℃灭菌20 min.

1.2.2孢子悬液的制备

接种黑曲霉的斜面培养至孢子长出, 加入5～8 mL无菌生理盐水, 用接种环刮取斜面上的孢子, 洗出的孢子液倒入装有玻璃珠的三角瓶中.充分振荡三角瓶将孢子分散,用灭菌的滤纸过滤后得到孢子悬液.用血细胞计数板测定孢子数量,稀释孢子悬液使孢子含量为1×106～5×106个/mL.

1.2.3纺织样品的准备及接种

称取(0.20±0.02) g的纯棉织物, 并剪成适当大小置于30 mL样品瓶中灭菌, 防止其他霉菌或细菌的生长.

将黑曲霉孢子悬液用SDB培养基稀释至适当浓度后, 吸取0.2 mL均匀接种于样品瓶中的布样上, 盖好瓶盖,在(25±2) ℃下培养(48±2) h.

1.2.4ATP提取方法

(1) 样品瓶中先加入2.3 mL生理盐水,再加入2.5 mL于100 ℃下预热的生理盐水,混合均匀后加热煮沸3 min, 冰浴降温至室温.

(2) 样品瓶中先加入2.3 mL生理盐水,再加入2.5 mL的PBS缓冲溶液,混合均匀后加热煮沸3 min, 冰浴降温至室温.

(3) 样品瓶中先加入2.3 mL生理盐水,再加入2.5 mL在100 ℃下预热的90%的DMSO,混合均匀后加热煮沸1 min, 冰浴降温至室温.

(4) 样品瓶中先加入0.8 mL生理盐水,再加入质量分数为3.0%的TCA溶液1 mL,置于漩涡振荡仪上振荡3 min, 加入3 mL的TE缓冲液稀释.

(5) 样品瓶中先加入0.8 mL生理盐水,再加入质量分数为0.05%的BAC溶液1 mL,置于漩涡振荡仪上振荡3 min, 加入3 mL的TE缓冲液稀释.

1.2.5提取剂溶液pH值的优化

配制质量分数为0.05%的BAC溶液, 用HCl和NaOH调节pH值分别为1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0以及13.1, 并按照BAC法提取黑曲霉ATP.

1.2.6提取剂浓度的优化

分别配制质量分数为0.01%, 0.05%, 0.20%, 0.30%, 0.40%, 0.50%, 0.60%, 0.70%和0.90%的BAC溶液,调节pH值为12±0.1, 按照BAC法进行黑曲霉ATP的提取.

1.2.7提取时间的优化

配制质量分数为0.50%的BAC溶液,调节pH值为12±0.1.向培养好的样品中加入0.8 mL生理盐水和1 mL的BAC溶液后, 分别在漩涡振荡仪上振荡0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 min, 加入TE缓冲液稀释.

1.2.8黑曲霉ATP发光值的测定

2　结果与讨论

2.1提取方法对ATP提取效果的影响

因不同微生物细胞壁和细胞膜的成分不同, 其胞内ATP的最适提取方法也不同.实验采用5种方法提取纯棉织物上生长的黑曲霉细胞内的ATP, 黑曲霉的接种浓度设为3个梯度, 孢子含量分别为1×105, 1×106和1×107个/mL, 探寻黑曲霉胞内ATP的适宜提取方法.所得ATP含量通过ATP发光法测量的发光值来判断, 以横坐标为孢子含量的对数值, 纵坐标为ATP发光平均值(U)的对数值作图, 实验结果如图1所示.从图1可看出, 3种孢子接种浓度下, 加热煮沸法提取ATP的效率均为最低.加热煮沸法提取ATP的原理是利用高温的作用将细胞破碎,同时使细胞内的ATP水解酶失活[6,9],由于加热破壁效果有限,导致提取ATP效果最差.DMSO法与PBS缓冲液法提取ATP效果相近.DMSO对黑曲霉细胞有破坏作用, 细胞结构破坏后释放出ATP[7].PBS缓冲液法的提取原理与加热煮沸法相似, 其通过缓冲体系的作用, 改变细胞壁及细胞膜的通透性, 因而提取效率有所提高.TCA法及BAC法目前广泛应用于细菌ATP的提取,在本实验中相对其他3种方法, 这两种方法的提取效率也较高.TCA对活细胞有两种作用：一是使细胞膜破裂从而释放出ATP, 二是使ATP水解酶失活.由于TCA对发光反应体系中的荧光素酶活性具有一定抑制作用,因此检测时需要进行大量的稀释, 从而对实验结果造成一定的影响[8,10].BAC作为季铵盐表面活性剂的代表, 化学结构为

BAC分子中既有亲水基团, 又有疏水基团, 在水中带正电荷, 而黑曲霉细胞带负电荷, 故BAC能够吸附聚集在黑曲霉细胞表面,进而渗入细胞的内脂层和蛋白层,导致细胞内酶钝化, 蛋白质变性聚集, 通透性改变, 微生物的代谢遭到破坏, 细胞内容物渗出, ATP随之释放.另外BAC的存在也有助于将黑曲霉孢子从布样上清洗下来,使得提取的黑曲霉ATP含量增加, 因而发光值提高[11-12].从本实验结果来看, TCA法和BAC法都适用于黑曲霉胞内ATP的提取.由于TCA法对荧光素酶的抑制作用,因而主要研究BAC法提取ATP的适宜条件.

图1　提取方法对ATP提取的影响Fig.1　The effect of extract methods on ATP extraction

2.2pH值对BAC法提取ATP效果的影响

提取剂的pH值不仅影响黑曲霉细胞的结构, 而且影响ATP发光系统, 不同pH值下黑曲霉ATP的提取结果如表1所示.

表1　pH值对ATP提取的影响Table 1　Effect of pH value on ATP extraction

由表1可知, 在酸性条件下, 随着提取液pH值的增大, ATP发光平均值逐渐增大, 当pH值达到4.0时, ATP发光平均值达到最大；pH值继续提高, ATP发光平均值开始下降.当pH值大于7.0后, 随着碱性的增强, ATP发光平均值逐渐增大, 当pH值为12.0时, ATP发光平均值达到最大值, 之后发光平均值开始下降.相对于pH值为4.0的酸性提取条件, pH值为12.0时ATP的发光平均值更高.采用BAC法提取ATP时,当酸性或碱性过强时, ATP发光平均值过低, pH值为13.1时, ATP发光平均值迅速下降到100以下.这一方面是由于极端的酸碱环境使ATP结构破坏,另一方面,过酸或过碱的条件会导致荧光素酶活性丧失[13].当提取液pH值偏中性时, 提取剂对细胞壁和细胞膜的破坏能力较小,使得ATP的提取效率较低,导致测得的发光平均值过低.因而pH值会显著影响ATP的提取效果, BAC提取黑曲霉ATP的最佳pH值为12.0.

文献[12]用两种浓度的BAC进行研究, 确定了大肠杆菌ATP提取的最佳pH值为5.2.文献[14]研究发现水体中微生物ATP的最佳提取pH值为7.7～8.0.由此表明, 不同菌种ATP提取的最佳pH值相差较大, 主要是由于不同微生物细胞壁及细胞膜的组成不同.

2.3BAC质量分数对ATP提取效果的影响

根据文献报道,采用BAC法对细菌ATP提取的最佳BAC质量分数从0.05%到0.20%不等[12,15].为了得到BAC法提取黑曲霉时所用的最佳BAC质量分数, 测试了不同浓度BAC溶液在pH值为12.0、提取时间为3 min时的提取效果,结果如图2所示.由图2可看出, BAC的质量分数对ATP的提取有很大影响, 在BAC质量分数低于0.40%时, 随着BAC质量分数的增大, 发光值也逐渐增大；当BAC质量分数为0.50%时, ATP发光值达到最高, 之后便开始显著下降.BAC属于阳离子型表面活性剂, 能够作用于黑曲霉细胞壁和细胞膜, 使其通透性改变并释放出ATP.另外, BAC的存在也有助于将黑曲霉孢子从布样上清洗下来, 使得提取的黑曲霉ATP含量增加,因而发光值提高.当BAC质量分数过高时也会影响荧光素酶的活性,从而导致发光值降低.因此, BAC法提取黑曲霉ATP的最佳质量分数为0.50%.

图2　BAC质量分数对ATP提取效果的影响Fig.2　The effect of mass fraction of BAC on ATP extraction

2.4提取时间对BAC法提取效果的影响

在ATP提取中, 提取时间短,则细胞内ATP提取不完全；提取时间长,会影响ATP分子的结构稳定性.另外，不同菌种提取时间差异较大, 一般提取时间为2～4 min[8,12,15].设定提取时间分别为1, 3, 4, 5, 6和8 min, 采用pH值为12.0、BAC质量分数为0.50%的溶液进行黑曲霉ATP提取,考察提取时间对ATP提取的影响, 结果如图3所示.

图3　提取时间对ATP提取效果的影响Fig.3　The effect of extraction time on ATP extraction

由图3可看出,当提取时间为5 min时, 发光值达到最大.当发光值达到最大后,黑曲霉的ATP已经全部释放,时间延长,ATP发光值反而降低.因此, BAC提取黑曲霉ATP的最佳时间为5 min.

3　结　语

本文选用5种方法用于棉织物上黑曲霉胞内ATP的提取,发现BAC法是最适宜的提取方法,该法提取ATP的最佳条件:BAC质量分数为0.50%, 提取液pH值为12.0, 提取时间为5 min.相比于现行的纺织品防霉检测所采用的观察霉菌在布样表面生长覆盖面积来判断霉菌生长情况的方法, 本文的检测方法一方面可以大大缩短检测时间(常规法需要接种培养28 d后观察布样上的霉菌生长面积, 而ATP发光法在接种培养2 d后即可立即测量)，另一方面，能够进行定量测试, 提高测试结果的准确度.

采用BAC法进行黑曲霉胞内ATP提取与其他提取方法相比, 其效率较高、操作简便, 且对荧光素酶活性的影响较小.但ATP的提取过程中荧光素酶的活性易受pH值、盐度以及金属离子(如K+、 Mg2+、 Ca2+等)影响, 因而在实际提取中需要进行探索并注意操作, 防止上述因素对实验结果造成影响.

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Extraction Methods of Intracellular ATP inAspergillusnigeron Cotton Fabric

WANGZhi-hui1,TANYu-jing2,YANGXue-xia1,ZHAOShu-hui1

(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology,Donghua University, Shanghai 201620, China;2. Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200040, China)

Extraction of intracellular adenosine triphosphate(ATP)is the key of detecting the amount of microorganisms by ATP luminescence. In order to determine the growth of filamentous fungi on pure cotton fabric,Aspergillusnigerinoculated on the cotton fabric was chosen as the experimental mode to study the ATP extraction methods. Five ATP extraction methods were compared, including boiling method, phosphate buffer method, trichloroacetic acid method, dimethyl sulfoxide method and benzalkonium chloride (BAC)method. The results showed that BAC method was the best method among five extraction methods and optimal conditions included 0.50%(mass fraction) BAC, pH value 12.0 and 5 min extraction time. Compared to the traditional detection method, the testing efficiency by determining the amount of ATP to determine the growth of filamentous fungi was significantly increased.

cotton fabric；Aspergillusniger； adenosine triphosphate(ATP)；bioluminescent method；extraction condition

1671-0444(2015)03-0324-05

2014-10-10

上海市质量技术监督局科研资助项目(2013-22)

王志惠(1990—)，女，山东泰安人，硕士研究生，研究方向为纺织品抗真菌检测方法.E-mail:wangzhihui200803@163.com

谭玉静(联系人)，女，高级工程师，E-mail:xiaotan98@126.com

TS 117

A