调肝导浊方对apoE-/-小鼠血脂及主动脉斑块面积的影响*

索艳荣，曾文赟，王一婧，李虎虎，郭茂娟，范英昌

（天津中医药大学，天津300193）

调肝导浊方对apoE-/-小鼠血脂及主动脉斑块面积的影响*

索艳荣，曾文赟，王一婧，李虎虎，郭茂娟，范英昌

（天津中医药大学，天津300193）

［目的］观察调肝导浊方对apoE-/-小鼠血脂及主动脉斑块的影响。［方法］将apoE-/-小鼠随机分成模型组和调肝导浊组并予以高脂饮食12周，C57BL/6L小鼠作为对照组给予普通饮食，12周后，检测各组小鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的水平；油红O染色评估主动脉斑块的范围；小动物超声仪检测主动脉的斑块面积及狭窄程度。［结果］模型组与对照组相比，TC、TG、HDL-C、LDL-C均升高（P＜0.05或P＜0.01）；调肝导浊组与模型组相比，LDL-C水平降低（P＜0.05），TC、TG、HDL-C无明显差异。油红O染色显示模型组的斑块范围最大，其次是调肝导浊组，最后是对照组。B超结果显示与对照组相比，模型组主动脉的斑块面积及狭窄程度明显增大（P＜0.01）；调肝导浊方干预后，斑块面积减小（P＜0.05），狭窄程度明显减轻（P＜0.01）。［结论］调肝导浊方可以降低apoE-/-小鼠的血清LDL-C水平，减少主动脉的斑块面积，并改善血管的狭窄程度。

动脉粥样硬化；apoE-/-小鼠；调肝导浊方；血脂；斑块

近年来，心脑血管疾病的发病率在全球逐年上升，严重危害着人类的生命健康。动脉粥样硬化（AS）是引发心脑血管疾病的最常见原因，对AS发病机制及防治措施的相关研究已成为全球研究的热点。目前，脂质浸润学说是较为公认的导致AS发病的假说之一，所以AS动物模型多采用高脂饲料喂养。此外，在动物模型的选择上发现apoE-/-小鼠的AS发病过程与人类极其相似，故apoE-/-小鼠成为研究AS最为理想的模型。调肝导浊方为张伯礼教授临床经验方，其由制何首乌、草决明、柴胡、茺蔚子、丹参、蒲黄、姜黄、泽泻组成。研究发现调肝导浊方对AS具有显著成效［1-2］。本研究采用apoE-/-小鼠观察调肝导浊方对AS血脂及主动脉斑块面积的影响。

1　材料和方法

1.1主要材料总胆固醇（TC）测定试剂盒、甘油三酯（TG）测定试剂盒、高密度脂蛋白（HDL-C）测定试剂盒、低密度脂蛋白（LDL-C）测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；油红O染料（Solarbio）；甲醛、异丙醇溶液（天津市双吉有限公司）；中药材（天津中医药大学第一附属医院中药房）；体式显微镜（德国Leica设备有限公司）；C5060-ADU照相机、全自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司）；VEVO2100小动物超声成像系统（加拿大Visualsonics公司）。

1.2动物分组及给药雄性apoE-/-小鼠12只，8～9周龄，体质量（20±2）g［南京大学国家基因工程动物资源库提供，许可证号：SCXK（苏）2010-0001］，饲养于天津市血液病研究所SPF级动物房。apoE-/-小鼠随机分为模型组和调肝导浊组（n=6）。同遗传背景的8～9周龄，体质量（20±2）g的雄性C57BL/6L小鼠［北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2009-0004］作为对照组（n=6）。模型组和调肝导浊组高脂饮食（1%胆固醇+10%猪油+普通饲料），对照组普通饮食12周，自由饮水。同时，调肝导浊组给予调肝导浊方（煎煮成汤汁后浓缩成含生药1 000 g/L）灌胃20 mL/（kg·d），模型组和对照组给予等量生理盐水。

1.3实验方法

1.3.1主动脉血管超声检测各组小鼠灌胃12周后，1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，胸部备皮，采用VEVO2100小动物超声成像系统，30 MHz进行超声检查。主动脉的内径、斑块内径及斑块面积采用超声图像分析软件对所获二维图像切面进行手动勾画并标记，计算机自动计算测量结果。

1.3.2血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的检测超声检查结束后，各组小鼠经目内眦取血至死。3000r/min离心15 min后取血清，-20℃冻存备用。血清TC采用COD-PAP法，TG采用GPO-PAP法，HDL-C采用磷钨酸-镁沉淀法，LDL-C采用聚乙烯硫酸沉淀法。具体操作步骤参考说明书。

1.3.3油红O染色解剖小鼠剪取完整主动脉，并以冰冻生理盐水冲洗，于体式镜下，快速剥离主动脉外膜，纵向剖开平铺后，置于4%多聚甲醛固定备用。将平铺后的主动脉于油红O染液内浸染10 min（若存在斑块，此区域将被染成红色），再用60%异丙醇分化，蒸馏水冲洗1～2 min，封片固定。采用C5060-ADU照相机于体式镜下拍照记录。

1.3.4统计方法采用SPSS 19.0统计分析软件，各组数据皆用均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05差异有统计学意义。

2　实验结果

2.1各组血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的检测由表1可以看出，模型组与对照组相比，TC、TG、HDL-C、LDL-C均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，调肝导浊组TC、TG和LDL-C有不同程度的降低，HDL-C略升高，其中LDL-C水平差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1　调肝导浊方对apoE-/-小鼠血脂水平的影响Tab.1　Effects of Tiaogan Daozhuo decoction on serum lipids in apoE-/-mice（

表1　调肝导浊方对apoE-/-小鼠血脂水平的影响Tab.1　Effects of Tiaogan Daozhuo decoction on serum lipids in apoE-/-mice（

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）对照组模型组调肝导浊组LDL-C（mmol/L）3.43±1.130.92±0.262.62±0.961.94±0.80 18.78±7.22**1.26±0.40*1.72±0.78*4.07±1.08** 14.19±3.571.05±0.341.79±0.852.02±0.84##

2.2主动脉油红O染色见图1。

图1　apoE-/-小鼠主动脉油红O染色Fig.1　Oil red staining of apoE-/-mice artery

从图1可以看出经油红O染色后，被染成红色的斑块主要集中在主动脉弓分叉处及腹主动脉以下的部位。对照组主动脉光滑平整，可见少量红色点状脂斑散在分布；模型组主动脉弓部见大量斑块集中分布，面积较大，腹主动脉区域也可见较多点状斑块；调肝导浊组斑块分布与模型组相近，但主动脉弓部斑块面积明显减小。

2.3主动脉的斑块面积及狭窄程度见图2及表2。

图2　主动脉的斑块面积及狭窄程度Fig.2　Small-animal ultrasonic imaging of apoE-/-miceartery

表2　调肝导浊方对apoE-/-小鼠主动脉斑块的影响（x±s）Tab.2　Effects of Tiaogan Daozhuo decoction on aortic plaques in apoE-/-mice（x±s）

图2显示的是apoE-/-小鼠主动脉弓的超声成像，图中弓形的管腔即为主动脉弓，中间低密度区为主动脉管腔。从图中可见对照组主动脉管壁粗糙，内膜稍增厚；模型组可见主动脉斑块形成（箭头所指处），突向管腔，局部血管腔狭窄；调肝导浊组血管壁光滑，内膜未见明显增厚。

表2显示各组小鼠血管内径基线一致，具有可比性；模型组与对照组相比，主动脉的斑块内径、面积及血管的狭窄程度明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；但经调肝导浊方干预后，斑块内径及面积缩小（P＜0.05），狭窄程度明显改善（P＜0.01）。

3　讨论

在动脉粥样硬化的发展过程中，脂代谢紊乱扮演着重要角色。脂代谢异常是AS形成的始动因素，并参与AS发生发展的多个环节，如炎症、内皮损伤，平滑肌的增生和迁移、细胞凋亡等［3］。TC、TG、HDL-C和LDL-C是诊断血脂异常的常用指标，其中LDL-C是将胆固醇运送至全身各个组织的重要载体，但其易被活性氧自由基、金属离子等氧化成具有毒性的oxLDL。oxLDL是AS形成的主要危险因子。它可以直接损伤内皮细胞，引发免疫炎症反应，血管舒缩障碍，导致内皮功能紊乱［4］。而内皮功能紊乱是AS的始动环节。同时oxLDL形成后，激活了免疫系统，募集了大量的炎细胞，分泌炎症因子和黏附分子，促进细胞的黏附和血小板的聚集，导致血管平滑肌细胞表型转变，使其增生、迁移，形成泡沫细胞，造成斑块，血管腔的狭窄［5］。现代研究表明oxLDL可以促进活性氧的产生，激活细胞内的凋亡信号通路，降低线粒体膜的通透性，促进细胞色素C和细胞凋亡蛋白酶-3的表达上调，及DNA修复酶PARP的分裂而导致细胞的凋亡［6］。由此可见，调整脂代谢的异常，尤其是降低LDL，抑制oxLDL的形成可有效预防AS的的发生、发展［7］。

斑块形成后，其所处的位置直接关系到血管事件的危险程度。据报道40.6%的缺血性中风患者主动脉处存在斑块［8］，这些斑块的危险性远比想象的大，尤其是当此处的斑块厚度＞4 mm或不稳定时，这种危险性更严重［9］。故有效的检测和评估动脉粥样硬化的程度对于血管事件的预防尤为重要。油红O是常用的一种脂质染料，它能将脂质染成红色。主动脉经油红O染色后可显现脂质存在的范围。B型超声是临床上常用的检查AS的技术设备，可清晰地分辨出血管斑块的大小及血管的狭窄程度［10］。小动物超声成像系统专门针对小型动物如：大鼠、小鼠而设计，能清晰地检测出小型动物器官的形态及体积大小［11］。本实验采用油红O及小动物超声成像系统评价各组小鼠主动脉斑块的面积大小及血管的狭窄程度，结果显示经高脂饲料造模后小鼠主动脉斑块形成，且主要位于主动脉弓及腹主动脉附近，调肝导浊方可以减小斑块的面积，改善血管的狭窄程度。

张伯礼教授认为肝主疏泄，调畅气机，气行则血行，气滞则血瘀。肝郁气滞，气不行津，津化为痰，痰浊瘀阻，久而酿生湿热，壅塞血道，导致动脉粥样硬化。故可应之以调肝导浊之法。调肝导浊方以法命名，方中姜黄破血行气；柴胡、草决明疏肝解郁，清泻肝火；茺蔚子、丹参清肝活血；蒲黄、泽泻化瘀止血，渗湿利水，予邪以出路；制何首乌，补肝肾，益精血以防清泻太过。现代研究表明姜黄、草决明、茺蔚子、泽泻、制何首乌及其有效成分具有明显的降脂作用［12-16］，柴胡中的有效成分柴胡皂苷具有抗炎，免疫调节作用［17］，而丹参、蒲黄具有直接的抗动脉粥样硬化作用［18-19］。前期实验也发现调肝导浊汤可通过调脂、抗氧化，抑制平滑肌增殖等作用抗家兔及大鼠的动脉粥样硬化的形成和发展［20-23］。

由以上实验结果可以看出经调肝导浊方干预后的apoE-/-小鼠血管的斑块面积大小及血管的狭窄程度明显小于模型组，说明调肝导浊方对AS具有治疗作用。同时调肝导浊方显著降低了apoE-/-小鼠血浆中的低密度脂蛋白水平。据此考虑调肝导浊方干预AS的进程可能与其调节低密度脂蛋白的代谢有关。但这一结果还有待进一步验证。

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（本文编辑：马英，于春泉）

Effects of Tiaogan Daozhuo prescription on blood lipid and aorta plaque area in apoE-/-mice

SUO Yan-rong，ZENG Wen-yun，WANG Yi-jing，LI Hu-hu，GUO Mao-juan，FAN Ying-chang
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the effect of Tiaogan Daozhuo prescription on the blood lipid and aortic plaque in apoE-/-mice.［Methods］ApoE-/-mice were randomly divided into model group and Tiaogan Daozhuo group，high fat diet for 12 weeks，C57BL/6L mice served as the control group were fed with normal diet，after 12 weeks，detection of serum TC，TG，HDL-C and LDL-C level，oil red O staining assessment aorta plaque scope；small animal ultrasound instrument to detect the aortic plaque area and degree of stenosis.［Results］TC，TG，HDL-C，LDL-C in the model group were higher than that in control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group LDL-C decreased in Tiaogan Daozhuo group（P＜0.05），and there was no significant difference of TC，TG and HDL-C.Oil red O staining showed that the range of plaque in the model group was the first，followed by the Tiaogan Daozhuo group，and the last was the control group.Compared with control group，the plaque area and stenosis of aorta in model group were significantly increased（P＜0.01），intervention by Tiaogan Daozhuo prescription.The plaque area was decreased（P＜0.05），and the degree of stenosis was significantly reduced（P＜0.01）.［Conclusion］Tiaogan Daozhuo prescription can decrease the serum levels of LDL-C in apoE-/-mice，and decrease the aortic plaque area and improve the degree of vascular stenosis.

atherosis；apoE-/-mice；Tiaogan Daozhuo prescription；blood fat；plaque

R223.11

A

1672-1519（2015）12-0739-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.10

国家自然科学基金项目（81202797）；天津市自然科学基金项目（08JCYBJC10800）。

索艳荣（1986-），女，博士在读，主要从事中医药防治动脉粥样硬化的研究。

郭茂娟，E-mail：maojuanguo@foxmail.com。

（2015-06-27）