针刺对痴呆小鼠大脑神经元超微结构的影响*

郭睿婧，付于，董树旭，刘宇婧，赵轼轩，郝婷婷，茹永新，张思彬，颜妙璇

（1.天津市环湖医院，天津300060；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193；3.中国医学科学院血液病医院电镜室，天津300020；4.天津中医药大学研究生院，天津300193）

·实验研究·

针刺对痴呆小鼠大脑神经元超微结构的影响*

郭睿婧1，付于2，董树旭3，刘宇婧4，赵轼轩3，郝婷婷4，茹永新3，张思彬4，颜妙璇4

（1.天津市环湖医院，天津300060；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193；3.中国医学科学院血液病医院电镜室，天津300020；4.天津中医药大学研究生院，天津300193）

［目的］研究三焦针法对痴呆小鼠皮质和海马CA1区神经元线粒体结构的影响。［方法］选取雄性SAMP8小鼠30只（随机分成模型组、非穴组、穴位组）和10只SAMR1小鼠（正常对照组）。持续治疗30日后，采用电子显微镜对小鼠大脑皮质顶叶和海马CA1区进行观察。［结果］R1组皮质顶叶和海马CA1区超微结构正常；SAMP8模型组小鼠神经元部分线粒体肿大、部分变性、部分脂肪化和坏死；SAMP8三焦针刺组线粒体肿大减少，少数线粒体变性，脂肪化和坏死；非经穴针刺组线粒体少数介于两者之间。［结论］三焦针法能有效改善SAMP8小鼠大脑皮质和海马CA1区神经原线粒体病理性损伤。

三焦；针灸；超微结构；阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病。该病起病隐匿、病程长、预后不良，临床以记忆障碍、失语、失用、失认、视觉空间感知障碍、执行功能和人格行为改变为特征［1］。AD是难治疾病，现代医学无特效根治手段，大部分属姑且或对症治疗，包括神经营养药、胆碱酯酶抑制剂、非药物干预及精神药物疗法，这些方法只能暂时缓解症状。中医通过辨证施治，给予中药和针灸治疗，临床报道有一定疗效［2-4］。

韩景献教授根据中医整体观，结合多年临床经验创立“三焦针法”在临床取得确切疗效，并在实验中得到证实［5-8］。本实验用透射电子显微镜观察三焦针法对AD模型小鼠（SAMP8）［9］海马、皮质神经元线粒体超微结构影响，研究三焦针法治疗AD疗效机制。

1　实验方法与步骤

1.1实验动物分组与饲养30只健康雄性8月龄SAMP8快速老化痴呆小鼠和10只SAMR1同品系小鼠由天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心提供，采用随机数字表法将SAMP8小鼠随机分为模型组、非穴组和穴位组，每组10只。4组小鼠在天津中医药大学第一附属医院清洁级动物中心饲养，温度（24±2）℃，自由采食。

1.2穴位选择和针刺手法SAMP8穴位组采用三焦针法进行针刺，取膻中、中脘、气海、双侧血海和双侧足三里针刺，穴位定位参照国家十五规划教材《实验针灸学》。针刺方法：血海穴施捻转泻法30 s，其余各穴分别施捻转补法30 s；非穴位组取双胁下两个固定非穴位点，平补平泻手法105s。两组小鼠每日针刺1次，幅度均为90°～180°，频率60～120 r/min，每个疗程6 d，休息1 d后进行下1个疗程，共治疗4个疗程。SAMR1组和模型组在同一时间用同样方法捉抓，但不进行针刺治疗。

1.3取材方法水合氯醛腹腔麻醉，小鼠停止活动后，将其仰卧固定于手术台，剪开胸腔，暴露心脏，用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注；待小鼠耳朵变白后，用4%多聚甲醛继续灌注，灌注结束后取出脑组织，分离海马CA1区和同侧顶叶皮质［10］，各切1 mm3大小方块，放入6%的戊二醛固定2 h。

1.4电镜标本制备1%锇酸后固定，蒸馏水洗两遍，用30%、70%、90%、100%乙醇逐级脱水，环氧丙烷过渡；然后用EPON包埋液浸透包埋，60℃烤箱聚合60 h；LeicaUC7型超薄切片机切片，厚度500 nm；醋酸铀避光染色10 min，铅染液染5 min，用H600电子显微镜观察和拍照。

1.5检测方法每组选3只鼠标本，每个标本在电镜15 000倍数下选3个视野拍照。用HPIAS-2000型图像分析系统测量照片内线粒体面积，计算小鼠线粒体平均面积；分析每张照片线粒体变性特点，包括空泡、脂肪滴、嵴消失、密度加深的线粒体，计算各组小鼠线粒体变性数。

1.6统计方法用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差表示，正态分布计量资料组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，偏态分布的计量资料组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1海马CA1区神经元超微结构变化SAMR1组小鼠CA1区神经元线粒体呈圆形或卵圆形，外膜光滑，内嵴清晰完整，内腔无扩张，基质密度均匀，无明显肿大，见图1A。SAMP8模型组小鼠线粒体部分形态规则，圆形或卵圆形，部分形态不规则，表面粗糙不平，部分外膜溶解，呈单层膜结构，内嵴排列紊乱或消失；部分线粒体肿大，内腔扩张，基质密度降低，甚至呈空泡状改变，少数线粒体密度增高和实变，见图1B。穴位组小鼠大部分线粒体为圆形或卵圆形，外膜呈双层结构，少数线粒体膜破坏、溶解，线粒体嵴排列紊乱，线粒体肿大和变性少于SAMP8模型组，见图1C。非穴组小鼠部分线粒体结构变化轻于模型组而重于穴位组，线粒体形态部分不规则，少数线粒体外膜溶解，内嵴轻度紊乱，线粒体轻度肿胀，内腔扩张，个别线粒体密度下降或空泡改变，见图1D。图像分析显示穴位组小鼠海马神经元线粒体平均面积大于SAMR1组，小于模型组与非穴组，各组间比较P＞0.05，无统计学意义；SAMR1组、针刺组神经元变性线粒体个数少于模型组，有统计学意义（P＜0.05）；非穴组线粒体多于针刺组，少于模型组，无统计学意义（P＞0.05）；SAMR1组与针刺组之间差异，无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2皮质顶叶神经元超微结构变化SAMR1组小鼠线所有粒体结构完整，形态规则，呈圆形和卵圆形，外膜光滑，内嵴清晰，内腔无扩张，基质密度均匀，线粒体无肿大，见图2A。模型组小鼠部分线粒体为圆形或卵圆形，部分不规则，外膜破坏、溶解，内嵴排列紊乱；部分肿胀，内腔扩张，密度降低，甚至形成空泡；部分线粒体密度加深，结构消失；有的线粒体脂肪化，见图2B。穴位组小鼠线粒体外膜破坏、溶解、嵴排列紊乱、空泡现象和线粒体肿大程度轻于模型组，见图2C，变性个数少于模型组；非穴位组线粒体损伤和蜕化程度介于模型组和穴位组之间，见图2D。图像分析显示穴位组线粒体平均面积小于其他3组，无统计学意义（P＞0.05）。神经元线粒体变性数：SAMR1组、穴位组的均少于模型组，有统计学意义（P＜0.05）；非穴位组神经元线粒体变性数介于针刺组和模型组之间，与两组比较无统计学意义（P＞0.05）；针刺组多于SAMR1组，但两组间无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　各组神经元线粒体平均面积和变性各组分析Tab.1　 Analysis of the size of the neuron mitochondrial average and the degeneration in each group（

表1　各组神经元线粒体平均面积和变性各组分析Tab.1　 Analysis of the size of the neuron mitochondrial average and the degeneration in each group（

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别面积（μm2）变性（个）H P P H SAMR1组模型组穴位组非穴组动物数10 10 10 10 0.66±0.11 0.92±0.44 0.71±0.20 0.92±0.33 0.94±0.23 0.98±0.40 0.80±0.30 0.87±0.14 3.00±2.45* 8.33±4.32 3.33±1.15* 6.00±3.74 2.33±1.52* 7.00±1.72 3.00±1.00** 4.67±2.08

图1　各组海马CA1区神经元超微结构变化Fig.1　Changes of the ultrastructural of the hippocampus CA1 area neurons in each group

3　讨论

随着生活水平提高和人口老龄化，全世界AD患病率逐年增加，截至2011年美国有540万患者，其中85岁以上人群一半受AD困扰［11-12］；中国60岁以上人群中AD患病率约1.6%，占所有失智症患者的三分之二［13］。作为困扰老年人生命和健康严重疾病之一，AD引起了广泛关注。现代医学和中国传统医学对该病认识不同，中医认为该病属呆病、癫症范畴，病位在脑，与上焦心肺、中焦脾胃、下焦肝肾等多个脏（腑）气化功能异常相关，三焦气化失常，气血津液升降出入不畅，导致清阳不升、浊阴不降，使痰湿、瘀浊阻滞脑窍发为呆病［14］。三焦针法立足于中医整体观理论，以益气调血，扶本培元和调畅气机为手段进行治疗［15-17］。益气可调脏腑气化异常，调血可祛除痰浊血瘀，扶本培元使气血生化无穷，针刺膻中、中脘、气海可激发三焦之气，维持上焦如雾、中焦如沤、下焦如渎状态；脾胃为后天之本，气血生化之源，脾为一切生痰之源，针刺中脘、足三里、血海可健脾养胃，生发气血，祛痰除湿；血海行血养血，两者相得益彰，清除诸邪，养脑清窍。

图2　各组皮质顶叶神经元超微结构变化Fig.2　Changes of the ultrastructural of the parietal cortex neurons in each group

现代医学将AD归为神经系统疾病，病理机制不完全清楚，主要包括如β-淀粉样蛋白瀑布假说（the amyloid cascade hypothesis）、Tau蛋白异常、神经血管损伤、线粒体损伤；炎性反应、氧化应激损伤，以及细胞周期调节蛋白障碍等；其中线粒体功能障碍得到更多的认可。线粒体嵴为合成ATP以维持细胞正常能量需要，是细胞能量工厂，线粒体损伤可导致细胞死亡，Kristinaleuner认为线粒体功能障碍启动了阿尔茨海默病一系列病理反应［18］。

本实验SAMP8模型组线粒体结构损伤与国外报道相符［19-20］，是研究AD的理想动物模型。实验结果显示穴位或非穴位针刺小鼠的海马和皮质神经元线粒体嵴较模型组完整，肿胀和变性程度改善，说明两种针刺方法均有效。其次，穴位针刺小鼠神经元线粒体形态结构接近SAMR1组，空泡和变性少于非穴组，说明三焦针法治疗效果好于其他非针刺方法。

总之，本实验证实三焦针法能保护SAMP8小鼠大脑神经元线粒体损伤，与笔者前期实验结果相符［21-22］，具体治疗机制有待于进一步深入研究。

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（本文编辑：马英，于春泉）

Effects on the acupuncture method on the ultrastructure of the cerebrum of 8-month-old swift aging mice

GUO Rui-jing1，FU Yu2，DONG Shu-xu3，LIU Yu-jing4，ZHAO Shi-xuan3，HAO Ting-ting4，RU Yong-xin3，ZHANG Si-bin4，YAN Miao-xuan4
（1.Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300060，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Laboratory of Electron Microscopy，Institute of Hematology and Hospital of Blood Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300020，China；4.Graduate School，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the influence of acupuncture method of triple energizer on ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of 8-month-old swift aging mice（SAMP8）.［Methods］The dementia mice were randomly divided into 3 groups: model group，acupuncture group and non-acupoint acupuncture group，and a normal group（SAMR1）group were set up.The mouse cerebral cortex and hippocampus CA1 region were observed by electron microscopy.［Results］Ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of the SAMR1 mice were almost normal.Acupuncture group had better expression on ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of SAMP8 mice than that in other two groups.［Conclusion］The acupuncture method of triple energizer has protective effects on ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of SAMP8 mice.

Sanjiao；acupuncture；electron microscopy；alzheimer's disease

R749.41

A

1672-1519（2015）12-0735-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.09

国家自然科学基金项目（81173414）。

郭睿婧（1988-），女，硕士，中医师，主要从事针灸抗衰老研究。

付于，E-mail：happyfu1970@163.com。

（2015-09-20）