曲普瑞林对人乳腺癌细胞Fas/FasL基因表达的影响*

龙　昱，粟　敏，李　妍，罗玥佶，朱传炳

（长沙医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室，湖南长沙410219）

曲普瑞林对人乳腺癌细胞Fas/FasL基因表达的影响*

龙昱，粟敏，李妍，罗玥佶，朱传炳*

（长沙医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室，湖南长沙410219）

为了观察GnRH激动剂曲普瑞林对人乳腺癌细胞生长的影响，探讨药物处理后细胞中Fas和FasL基因的表达情况及其与细胞生长的关系，本研究采用了形态学显微镜观察、MTT检测和Real-time PCR技术，对曲普瑞林处理后乳腺癌细胞的生长增殖情况及Fas和FasL基因表达的变化进行了研究。结果显示，曲普瑞林可抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长并表现出了剂量依赖性，药物浓度越大对肿瘤细胞的抑制作用越强。随着药物浓度的增大、抑制作用增强，肿瘤细胞中Fas基因的表达量逐渐增大，而FasL基因的表达量却逐渐下降。推测曲普瑞林在作用过程中可能通过促进肿瘤细胞中Fas的表达，诱导了Fas所介导的细胞凋亡途径的恢复，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

曲普瑞林；乳腺癌；Fas；FasL

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.010

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率已位居女性恶性肿瘤的首位。近年来，一些人工合成的促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）类似物（如曲普瑞林、阿拉瑞林等）作为肿瘤内分泌治疗的药物已用于女性生殖系肿瘤、前列腺癌等病症的临床治疗，可起到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用［1-2］。GnRH是由下丘脑神经元分泌的一种十肽激素，是调节机体内分泌系统和生殖系统的重要信号分子［3-4］。目前已在许多激素依赖性肿瘤细胞中发现有GnRH的结合位点，GnRH或其类似物能作为肿瘤细胞自分泌调节因子调控肿瘤的生长和分化［5-7］。乳腺癌作为一种激素依赖性肿瘤，其癌细胞上也发现有GnRH及其受体的表达［8］，GnRH激动剂可抑制癌细胞的生长，推测可能是通过诱导细胞凋亡来实现，但具体作用机制目前尚不明确。Fas又称为APO-1，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体和神经生长因子（NGF）受体家族，是细胞凋亡的信号分子，也称为“死亡受体”。FasL是Fas在人体内的天然配体，当Fas与FasL结合后，可活化并传导凋亡信号，触发Fas所在靶细胞数小时内凋亡。研究表明多种恶性肿瘤如乳腺癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、肺癌等组织内有Fas/FasL的表达，其在肿瘤的发生、发展及转移过程中有重要作用［9-13］。本研究以人乳腺癌细胞为研究对象，用不同浓度GnRH激动剂曲普瑞林（Triptorelin）处理乳腺癌细胞，观察药物对细胞增殖活性的影响；并对药物处理后Fas/FasL在癌细胞中的表达水平变化进行比较研究，分析Fas/FasL表达差异与癌细胞增殖活性的相关性，探讨GnRH激动剂诱导细胞凋亡进而抑制生殖系肿瘤细胞增殖的分子机制，为深入研究肿瘤的内分泌治疗机理提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

人乳腺癌细胞MCF-7（ER+）由中国科学院上海细胞库提供。DMEM培养基和澳洲胎牛血清购自Hyclone公司。反转录试剂盒、Taq酶及DNA Marker均够自上海生工生物工程公司。曲普瑞林为白色粉末，使用前用PBS配置成所需的各种浓度。

实验中所使用的引物均是根据GenBank中人的Fas、FasL及内参β-actin的mRNA序列，用软件Primer Premier 5.0设计，由上海生工生物工程公司合成引物。

Fas引物序列为:

上游:5′-ATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAA-3′，

下游:5′-TGCACTTGGTGTTGCTGGTGAGTG-3′；

FasL引物序列为:

上游:5′-CACTACCGCTGCCACCCCTGA-3′，

下游:5′-CATCATCTTCCCCTCCATCATCACC-3′；

β-actin引物序列为:

上游:5′-GGCTGTTTTCCCATCCATCG-3′，

下游:5′-CCCATTCCAACCATTACTCCCTG-3′

1.2方法

1.2.1细胞培养 将1×105的处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7接种于24孔培养板内进行培养。24 h后，分别加入不同浓度的曲普瑞林（依次为10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L 6个浓度组），每个浓度均设置3个复孔，另外再设置对照孔和无细胞调零孔。然后置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中，分别培养24 h、48 h和72 h，倒置显微镜下进行观察。

1.2.2MTT法检测细胞抑制率 实验终止前4 h，每孔加入50 μL MTT溶液（MTT用PBS配成5 mg/ mL，即0.5%MTT）。继续培养4 h后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），置于摇床上低速振荡10 min。酶联免疫检测仪A570nm测量各孔的吸光度值。将所测定的结果按下式计算生长抑制率IR（%）:生长抑制率IR（%）=（1-实验组平均A570nm/对照组平均A570nm）×100%。实验全部数据借助EXCEL中的统计软件进行处理，t检测分析显著性水平。

1.2.3Real-time PCR 分别收集细胞并提取其RNA，使用Promega反转录试剂盒进行反转录。Realtime PCR反应体系为20 μL，其中各引物浓度为20 nmol/L，每管加10 μL的SYBR Green PCR Master Mix（ABI）、5 μL cDNA模板，再用无菌水定容至20 μL。Real-time PCR反应及检测在Prism 7 500 Sequence Detection System（ABI）上进行。对每一种样品的分析都重复三次，包括目标基因（Fas、FasL）和作为内参的管家基因（β-actin），以保证结果的准确性。Real-time PCR的反应条件为:50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，61℃45 s，40个循环。用相对标准曲线法2-ΔΔCt对相对定量的结果进行分析，得到相对表达量图谱，最后用熔解曲线法来检测实时定量PCR的产物。

2　实验结果

2.1不同浓度曲普瑞林对MCF-7细胞生长的影响

用10-4～10-9mol/L浓度范围内的曲普瑞林分别作用于MCF-7细胞，在培养24 h、48 h和72 h后，药物对细胞增殖活性的影响结果见表1和图1。结果表明，在10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L等浓度曲普瑞林的作用下，MCF-7细胞的生长均受到了不同程度的抑制。并且随着药物浓度的增加，对细胞的抑制作用不断增强，其中浓度为10-4mol/L的曲普瑞林对不同培养时间内（24 h、48 h、72 h）MCF-7细胞生长的抑制作用均表现为最强（P＜0.01）。此外，通过观察同种药物浓度处理下的细胞在不同培养时间的生长情况发现，48 h时的细胞抑制率较24 h时略有降低，但作用72 h时后，细胞抑制率又明显增大。说明随着药物作用时间的延长，药物对细胞生长的抑制作用有明显增强。

表1　曲普瑞林对MCF-7乳腺癌细胞增生活性影响的MTT实验结果Tab.1　The MTT experimental results of the effect of triptorelin on the growth of breast cancer cells

图1　不同浓度曲普瑞林处理24 h、48 h、72 h后MCF-7细胞的生长情况Fig.1　The growth of MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin after 24 h，48 h and 72 h

2.2Fas及FasL基因表达的半定量分析

经MTT实验发现，药物处理72 h后，各种浓度的曲普瑞林对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用均表现出最强，因此选择药物处理72 h后的细胞进行Fas和FasL表达量的分析。不同浓度曲普瑞林处理72 h后，MCF-7细胞中Fas和FasL表达的Real-time PCR结果分别见图2和图3。溶解曲线和PAGE胶检测结果均显示扩增产物单一且大小符合预期设计。由图2可见，Fas基因在无药物处理的MCF-7细胞中表达量较低，但经过不同浓度曲普瑞林处理72 h后，Fas基因在细胞中的表达量随着药物浓度的增加而增大，其中10-4mol/L药物处理后的细胞中Fas基因的表达量最高，10-9mol/L药物处理后的细胞中Fas基因的表达量最低。

图2　不同浓度曲普瑞林处理后MCF-7细胞中Fas基因表达情况Fig.2　The expression of Fas gene in MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin control

而由图3可见，FasL基因在无药物处理的MCF-7细胞中表达量较高，在经过不同浓度曲普瑞林处理72 h后，FasL基因在细胞中的表达量随着药物浓度的增加而逐渐降低，其中10-9mol/L药物处理后的细胞中FasL基因的表达量最高，10-4mol/L药物处理后的细胞中FasL基因的表达量最低。这与上述Fas基因的表达情况相反。

图3　不同浓度曲普瑞林处理后MCF-7细胞中FasL基因表达情况Fig.3　The expression of FasL gene in MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin control

3　讨论

实验研究和临床观察都提示，在一些激素依赖性肿瘤如宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌及乳腺癌等的细胞中均存在GnRH结合位点［5-7］，GnRH可作为调节因子调控肿瘤细胞的生长、分化。而在使用GnRH类似物对卵巢癌、子宫内膜癌及乳腺癌的治疗中也发现其对相应的肿瘤细胞的生长有抑制作用［1，14-15］，但具体机制尚不十分清楚，推测其可能与诱导细胞凋亡有关系［16-18］。本实验中使用的曲普瑞林为人工合成的GnRH激动剂，实验结果也发现曲普瑞林能抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长，药物浓度越高，抑制作用越明显，表现出了剂量依赖性。并且随着药物处理时间的延长，72 h后药物对细胞的抑制作用要明显高于24 h和48 h，说明药物对细胞的抑制作用随着时间的增加而增强。

Fas/FasL系统是细胞凋亡中最主要的途径之一，Fas是细胞凋亡的信号，当其与配体FasL结合后，活化并传导凋亡信号，从而诱导细胞的凋亡。研究发现很多肿瘤细胞上都有Fas抗原的表达，这些肿瘤可通过Fas反攻击模式作为逃避机体免疫识别和杀伤的方式，肿瘤细胞通过低表达或不表达Fas而自身表达FasL来诱导肿瘤组织中浸润的淋巴细胞发生凋亡，从而得以逃避免疫细胞的杀伤及自身的凋亡作用。比如，在一些肿瘤（如卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、黑色素瘤、肝癌等）的发展过程中伴有肿瘤细胞中Fas的表达下调或缺失，使细胞对Fas/FasL介导的凋亡产生抵抗，从而使得肿瘤细胞逃避免疫监控而存活，引起肿瘤增殖［9，19］。此外，在对肺癌、子宫内膜癌的研究中发现Fas与FasL表达水平呈负相关，随着癌细胞恶性程度的增加，Fas下调明显，FasL表达水平则增高，其逃避机体免疫监视的能力也逐步增强，转移能力增强［20］。而在一些肿瘤如宫颈癌的化学治疗后，可以观察到癌细胞增殖活性受抑制并出现凋亡现象的同时，还伴随有Fas表达的上升和FasL表达的下降［21］。

本实验中我们利用不同浓度的GnRH激动剂曲普瑞林处理乳腺癌细胞MCF-7后，使用Real-time PCR方法检测了Fas/FasL基因表达量的变化。结果发现在无药物处理的肿瘤细胞中，Fas的表达量相对较低，而FasL的表达量相对较高，这与其他乳腺癌发生发展研究中所观察到的Fas下调和FasL上调的结果相似［22］。而在曲普瑞林的作用下，随着药物浓度的增大、抑制作用的增强，MCF-7细胞中Fas的表达量逐渐增加，但FasL的表达量相对于无药物处理时反而出现了降低。这说明曲普瑞林在作用过程中可能促进了肿瘤细胞中Fas的表达，但抑制了FasL的表达，从而诱导了Fas所介导的细胞凋亡途径的恢复，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

因此，我们认为GnRH激动剂曲普瑞林对乳腺癌细胞的生长有一定的抑制作用，并且这种抑制作用与刺激浓度及作用时间有关系。推测曲普瑞林作为临床上的肿瘤内分泌治疗的药物，其抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与其诱导了Fas/FasL介导的细胞凋亡途径的恢复，从而抑制了癌细胞的生长有一定关系。但Fas/FasL介导的细胞凋亡本身是一个复杂的过程，更具体的作用机制还有待于进一步的研究。

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Effect of Triptorelin on Fas/FasL Gene Expression in Human Breast Cancer

LONG Yu，SU Min，LI Yan，LUO Yueji，ZHU Chuanbing*
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Changsha Medical University，Changsha 410219，Hunan，China）

In order to observe the effect of GnRH aganist triptorelin on the growth of human breast cancer cells，and to explore the expression of Fas and FasL gene in drug treated cells and its relationship with cell growth，the morphological microscope，MTT detection and Real-time PCR were used to study the proliferation and the expression of Fas and FasL gene of breast cancer cells which were treated by the triptorelin.The results showed that triptorelin could inhibit the growth of breast cancer cells MCF-7 and exhibited a characteristic of dose-dependent，the higher the concentration of drugs，the stronger inhibition of tumor cells.It was also observed that the higher the concentration of reagents，the expression of Fas gene in breast cancer cells gradually increased，but the expression of FasL gene was gradually decreased. Therefore，it suggested that the triptorelin might promote the expression of Fas gene in tumor cells，which induced the recovery of the Fas mediated apoptosis pathway，then the growth of tumor cells were inhibited.

triptorelin；breast cancer；Fas；FasL

R737.9

A

1007-7146（2015）04-0358-06

2015-05-02；

2015-06-12

湖南省科技厅科技计划资助项目（2011FJ3096）；湖南省教育厅科学研究资助项目（No.10C0467）

龙昱（1982-），女，土家族，湖南长沙人，副教授，博士，主要从事内分泌学及肿瘤生物化学研究。（手机）13787129182；（电子邮箱）19429068@qq.com

朱传炳（1948-），男，湖南长沙人，教授，学士，主要从事心脏发育的基因调控及分子信号转导研究。（手机）13787006775；（电子邮箱）12298634@qq.com