丹参愈伤组织培养中激素浓度的优化研究*

荆瑞勇，王丽艳，郭永霞

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆163319）

丹参愈伤组织培养中激素浓度的优化研究*

荆瑞勇，王丽艳，郭永霞*

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆163319）

目的：优化丹参愈伤组织继代培养中激素浓度的最佳组合。方法：以丹参种子为外植体，以无菌苗下胚轴诱导的初代愈伤组织为材料，以愈伤组织净增鲜重为指标，利用二次正交旋转组合设计方法进行数学模拟，建立数学模型，利用响应面法进行激素浓度组合寻优。结果：丹参愈伤组织继代培养中激素浓度的最佳组合为6-BA 1.514 mg/L+NAA 2.059 mg/L+2，4-D 2.137 mg/L；愈伤组织的净增殖鲜重为35.66 g。

丹参；响应面法；愈伤组织；激素浓度

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.014

丹参（Saliae Miltiorrhiza Bge）为唇形科鼠尾草属多年生草本植物。其有效成分为丹参酮、隐丹参酮、丹参新酮、原儿茶醛、鼠尾草酚等。中药中以其根及根茎入药，具有去瘀生新、活血调经、消肿止痛、镇静安神等功效，因此临床上用于治疗产后瘀阻腹痛、月经不调、痛经、神经衰弱失眠等症状。另外丹参在人类心脑血管疾病、抗衰老、抗癌等方面具有良好的治疗效果［1，2］。随着丹参制剂在国内外心血管药物市场上的占有量不断提高对丹参的需求量迅速扩大。

中草药药用成分可以通过三种方式获得:一是可用植株提取；二是经愈伤组织细胞悬浮培养方式获得；三是经毛状根培养获得。三种方式各有优缺点，第一种方式是受自然资源的限制；后两种方式是难于找到最佳的培养条件。本文以丹参下胚轴为外植体进行愈伤组织诱导，对愈伤组织增殖的培养基利用响应面法进行优化，并对悬浮培养做了初步研究，为悬浮细胞的培养和丹参愈伤组织的扩大化培养提供理论依据和技术支持。

1　材料与方法

1.1试验材料

丹参种子，购于河北省安国市药材市场。

1.2试验方法

1.2.1丹参种子的消毒方法 首先将丹参种子用清水冲干净，然后在超净工作台中先用75%乙醇浸泡种子2 min，将乙醇倒出后再用0.1%升汞溶液浸泡种子15 min后倒出，最后用无菌蒸馏水冲洗5次后，备用。

1.2.2丹参初代愈伤组织的获得 将消毒好备用的丹参种子接种于MS基本培养基中进行发芽暗培养。待苗长到3-5 cm高时，将其下胚轴切割成约0.5 cm长的小段放入培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D中进行初代愈伤组织的诱导培养。

1.2.3培养基及试验设计 基本培养基选用MS；选择组织培养中最常用的三种激素6-BA（6-苄氨基嘌呤），2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），NAA（萘乙酸）为试验因素。各因素变化区间由预试验确定，查表确定星号臂即γ值，结果见表1。用二次正交旋转组合设计安排试验见表2。

1.2.4丹参愈伤组织最佳培养基的筛选 将培养15 d的初代愈伤组织切成大小平均为0.25 g的小块接入表2的培养基中进行继代培养，每个处理接种5瓶，每瓶4块，每个处理总计20块，总质量为5 g，即初始鲜重为5 g。接种15 d以后，将愈伤组织取出去除干净培养基后进行鲜重的称量即为最终鲜重，以净增鲜重（即最终鲜重-初始鲜重）为指标进行最佳培养基的筛选。

1.2.5数据分析 二次正交旋转组合设计试验的数据按照二次回归方程的预测模型进行回归分析。分析软件使用SAS（Statistical Analysis System）9.1，自编程序。

表1　试验因素水平编码表Tab.1　Coded levels of variables of the orthogonal rotary composite experimental design

2　结果与分析

2.1回归模型的建立与检验

根据表2中的数据，利用SAS RSREG Procedure对试验数据进行分析，得到回归模型如下:y=-45.

对模型（式1）进行方差分析，结果（表3）表明:此模型的决定系数R2为0.9548，回归模型达到高度显著水平（P＜0.0001），说明此模型能够95.48%的模拟实际情况。逐项显著性检验结果表明，线性项和二次项对试验结果均有极显著性影响，其决定系数分别为0.3676和0.5849。而互作项对试验结果无显著性影响，其决定系数仅为0.0023。对模型失拟进行显著性检测，结果P=0.2079＞0.05，不显著，说明该二次模型能够拟合真实的试验结果［5］。

对回归模型各系数的显著性分析，结果（表4）表明:各互作项的系数显著性大于0.05，其余各项均小于0.05，因此优化后得到的模型为:y=-45.176

2.2培养基激素浓度组合寻优

利用RSREG Procedure进行典型分析，得到一个稳定点见表5:6-BA（x1）为1.169 mg/L、NAA（x2）为1.118 mg/L、2，4-D（x3）为1.130 mg/L，并判断该点为最大值点，其愈伤组织净增鲜重（y）为35. 66 g。

以MS+6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L +2，4-D 1.130 mg/L为培养基，接种愈伤组织，接种5瓶，每瓶4块，总计20块，总质量为5 g，重复试验3次，培养15 d后称取愈伤组织净增鲜重分别为34.45 g、34.05 g、36.85 g平均为35.12 g，略低于预测值，但差值小于5%。因此可将6-BA（x1）为1.169 mg/L、NAA（x2）为1.118 mg/L、2，4-D（x3）为1.130 mg/L作为增殖培养基激素的最佳浓度组合。应用丹参愈伤组织继代培养的最佳培养基MS +6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L+2，4-D 1.130 mg/L，培养出的愈伤组织较疏松，为黄绿色（图1）。

表2　正交旋转组合试验设计方案及结果Tab.2　Quadratic orthogonal rotary composite experimental design and experimental result

表3　二次响应面回归模型方差分析Tab.3　Analysis of variance（ANOVA）of the regression model of quadratic response

表4　回归模型系数的显著性分析Tab.4　Analysis of variance for regression model

表5　典形分析（稳定点、特征值和特征向量表）Tab.5　Canonical analysis of response surface based on coded data（stationary point，eigenvalues and eigenvectors）

图1　最佳培养基诱导出的愈伤组织Fig.1　Callus induced under optimized culture condition

2.4丹参细胞悬浮培养

将在筛选出的最佳培养基上生长的愈伤组织接种到不加琼脂的液体培养基:MS+6-BA 1.169 mg/L +NAA 1.118 mg/L+2，4-D1.130 mg/L中进行液体悬浮培养，结果发现:在此培养基中悬浮细胞生长良好，培养周期为15 d，悬浮细胞团为淡黄褐色，最大的细胞团如黄豆粒般大小（图2）。

3　小结与讨论

通过数学模拟得到的模型为:y=-45.176+17. 705·x1+79.102·x2+46.496·x3-7.578·x12-34.185· x22-20.785·x32。通过模拟寻优得到的丹参愈伤组织继代培养的最佳培养基为:MS+6-BA 1.169 mg/L+ NAA 1.118 mg/L+2，4-D 1.130 mg/L，其愈伤组织净增鲜重y为35.66 g。

影响植物组织培养成功的因素有很多，其中最主要的是激素的种类和浓度。在植物组织培养激素优化的过程中可利用多种试验设计，其中采用完全随机试验设计的比较多，在旱半夏继代增殖培养基的筛选过程中就利用了完全随机试验设计方法［3］；在荠菜芽分化增殖最适培养基的筛选中也利用了此设计方法［4］。但此种设计方法不适用于试验因素和水平较多的试验，因处理太多而导致工作量过大。采用正交试验设计的也很多，如在丹参愈伤组织诱导的培养基优化的过程中［5］。在山豆根组织培养激素优化过程中［6］。但这种方法同样需要重复试验，得到的结论也都是设计好的一些因素的点的组合，相对来说还是不够精确。而本试验中采用的二次正交旋转组合设计具有试验次数少、计算简便，并且能根据预测值直接寻求最优区域的优点，因此得到结果更加精确。利用这种设计方法进行培养基优化的也有相关的报道，如在甘草［7］、大豆［8］愈伤组织增殖培养过程中。本试验通过响应面优化出的最佳培养基为MS+6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L+2，4-D1.130 mg/L，与柳福智［9］的研究结果NAA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L相近，但较其更为精确。

图2　悬浮细胞Fig.2　Suspension cells

［1］ 徐任生.丹参-生物学及应用［M］.北京:科学出版社，1990: 158-184. XU Rensheng.Biology and Application of Saliae Miltiorrhiza Bge［M］.Beijing:Science Press，1990:158-184.

［2］LIU Jin，SHEN Hanming，ONG CHOON-NAM.Salvia Miltiorrhiza inhibits cell growth and induces Apoptosis in human Hepatoma Hepatoma HepG2 cells［J］.Canc Lett，2000，153（1-2）:85-93.

［3］王丽艳，荆瑞勇，谭焕波，等.旱半夏组织培养条件的优化研究［J］.时珍国医国药，2008，19（7）:1795-1796. WANG Liyan，JING Ruiyong，TAN Huanbo，et al.Optimization of tissue culture condition on Pinellia tenata（Thumb）Breit［J］. LISHIZHEN Medicine and Material Mediaca Research，2008，19（7）:1795-1796.

［4］王丽艳，荆瑞勇，郭培磊.荠菜无菌快速繁殖技术的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2007，19（3）:13-16. WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Peilei.Study on rapid propagation technology of Capsella bursa-pastoris［J］.Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University，2007，19（3）:13-16.

［5］客绍英，石洪凌，马作东，等.利用正交试验优化丹参愈伤组织培养［J］.中药材，2005，28（2）:82-83. KE Shaoying，SHI Hongling，MA Zuodong，et al.Optimaization of callus tissue culture saliae miltiorrhiza bge by orthogonality design［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2005，28（2）: 82-83.

［6］李林轩，韦坤华，唐美琼，等.正交试验优化山豆根组织培养条件［J］.中药材，2012，35（4）:514-517. LI Linxuan，WEI Shenhua，TANG Meiqiong，et al.Optimization of tissue culture of Sophora tonkinensis Gagnep by orthogonality design［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2012，35（4）: 514-517.

［7］王丽艳，荆瑞勇，殷奎德.甘草愈伤组织继代培养中激素浓度组合的优化研究［J］.激光生物学报，2010，19（6）:848-852，842. WANG Liyan，JING Ruiyong，YIN Kuide.Optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Glycyrrhiza uralensis［J］.Acta laser Biology Sinica，2010，19（6）:848-852，842.

［8］王丽艳，荆瑞勇，郭永霞，等.大豆愈伤组织继代培养中激素浓度组合的优化研究［J］.中国油料作物学报，2013，35（4）: 446-450. WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Yongxia，et al.Study on optimum hormone concentration during subculture of soybean callus tissue［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciencer，2013，35（4）: 446-450.

［9］柳福智.丹参愈伤组织诱导与有效成分含量的研究［D］.陕西:西北农林科技大学，2006. LIU Fuzhi.Induction of callus tissue of Saliae miltiorrhiza Bge and content of effective elements［D］.Shanxi:Northwest Agriculture& Forestry University，2006.

Study on Optimization of Hormone Concentration in Callus Culture of Saliae Miltiorrhiza Bge

JING Ruiyong，WANG Liyan，GUO Yongxia*
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，Heilongjiang，China）

Objective:To seek optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Glycyrrhiza uralensis.Methods:The seed of Saliae Miltiorrhiza Bge as explants，first generation callus induced by embryo root and hypocotyledonary axis of sterilized seed as material，the net fresh weight of callus as indicator，mathematical model were established by quadratic orthogonal rotary composite experimental design.The concentration of hormones were optimized by method of response surface.Result:The optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Saliae Miltiorrhiza Bge is 6-BA 1.514 mg/L，NAA 2.059 mg/L，2，4-D 2.137 mg/L.The net fresh weight of callus is 35.66g.

Saliae Miltiorrhiza Bge；method of response surface；callus；hormone concentration

S567.1

A

1007-7146（2015）04-0377-05

2014-12-09；

2015-02-03

黑龙江省自然科学基金（QC2012C049）

荆瑞勇（1978-），男，内蒙人，博士后，讲师，主要从事生物技术方面研究。（电话）0459-6819299-810；（电子信箱）jry_2002@126.com

郭永霞（1970-），女，黑龙江人，博导，教授，主要从事生物技术方面研究。（电话）+86-459-6813789；（电子信箱）gyxia@163.com