醋酸曲普瑞林有关物质HPLC分析方法研究

伏圣青，黄哲甦

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

曲普瑞林为合成的促性腺激素释放激素十肽类似物，其结构类似戈舍瑞林，以治疗剂量持续给药时，本品强有力地抑制促性激素的分泌，活性强于天然的GnRH。其注射剂在临床上有多种用途，其用于临床中的女性不孕症、体外受精-胚胎移植程序中诱导排卵、术前子宫肌瘤的治疗、生殖器内外的子宫内膜异位症、男性前列腺癌的保守治疗以及儿童性早熟[1-6]。目前《美国药典》、《英国药典》和《欧洲药典》均未对该品种进行收载，2015版《中国药典》收载了曲普瑞林原料药以及0.1 mg/ml规格制剂的质量标准，在有关物质检查项下采用了主成分自身对照法对单个杂质和总杂质进行了限定，并未对具体杂质做出要求[7]。根据曲普瑞林的生产工艺相关文献资料的研究，在曲普瑞林有关物质中现已确认出其中4种已知杂质，分别为D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林。本方法建立了反相高效液相色谱法对曲普瑞林4种已知有关物质及其未知杂质进行分析测定[8]，为曲普瑞林质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

安捷伦公司1260 高效液相色谱仪；Milli-Q纯水仪(Merck公司)； 电子天平(梅特勒-托利多，精度: 十万分之一)。醋酸曲普瑞林对照品(含量:88.2%，批号1064528)、D-丝氨酸4-曲普瑞林对照品(含量: 80.7%，批号4025363)、D-酪氨酸5-曲普瑞林对照品(含量:80.2%，批号4025365)、游离酸对照品(含量: 79.8%，批号4026526)、D-亮氨酸7-曲普瑞林对照品(含量: 82.6%，批号4025366)、三批醋酸曲普瑞林样品(批号分别为1058451、1058452、1058454，分别命名为样品1、样品2、样品3)均来自瑞士Bachem AG公司。磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为分析纯，乙腈为色谱纯(Merck公司)，超纯水为Milli-Q自制。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：XTERRA®RP18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.068 mol/L磷酸盐缓冲液(0.034 mol/L KH2PO4和0.034 mol/L Na2HPO4的水溶液，调节pH值至6.85)为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱程序见表1；检测波长：220 nm；柱温：35 ℃；流速: 1.5 ml/min；进样量:10 μl。

表1 梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取醋酸曲普瑞林对照品约20 mg置50 ml 量瓶中，加适量0.1%磷酸溶液使溶解，继续用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，混匀，作为对照品贮备液；精密量取醋酸曲普瑞林对照品贮备液5 ml至50 ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释定容至刻度，摇匀，即得醋酸曲普瑞林对照品溶液。精密称取D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林各约10 mg，分别置100 ml量瓶中，加适量0.1%磷酸溶液使溶解，并用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，混匀，作为D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林对照品贮备液。

2.2.2系统适用性溶液的制备 精密称取醋酸曲普瑞林约100 mg，置25 ml量瓶中，分别精密加入D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林对照品贮备液各5 ml使溶解，并用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 精密称取样品1、样品2、样品3各约90 mg，分别置25 ml量瓶中，加入适量0.1%磷酸溶液溶解，再加入0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液1、2、3。

2.3系统适用性考查 在建立的色谱条件下精密量取系统适用性溶液及供试品溶液1各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，在该色谱条件下系统适用性溶液中的5种成分分离良好，供试品溶液中有关物质准确检出，色谱图见图1，分离度详见表2。

表2 5种成分分离度

1．D-丝氨酸4-曲普瑞林 2.D-酪氨酸5-曲普瑞林 3.游离酸 4.曲普瑞林 5.D-亮氨酸7-曲普瑞林 6.未知有关物质 7.未知有关物质图1 曲普瑞林系统适用性溶液(A)供试品溶液(B)HPLC色谱图

2.4线性关系考查及校正因子测定 取“2.2.1”项下对照品贮备液10、7.5、5、2.5和1 ml，分别置于100 ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释定容，摇匀；精密量取“2.2.1”项下D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸及D-亮氨酸7-曲普瑞林贮备液10、7.5、5、2.5和1 ml，分别置于25 ml 量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释定容摇匀。按“2.1”项下色谱条件进样分析，以浓度(X，μg/ml)为横坐标，峰面积(Y) 为纵坐标，进行线性回归，结果表明醋酸曲普瑞林及其4 种有关物质在各自相应浓度范围内与峰面积线性关系良好，各有关物质对曲普瑞林的校正因子均在0.95～1.1之间，见表3。

2.5检测限和定量限的测定 将“2.2.1”项下对照品溶液用流动相逐级稀释进样，当信噪比约为3时，测得为检出限；当信噪比约为10时，测得为定量限。结果表明，醋酸曲普瑞林、D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林的检测限分别为18、15、14、16 和18 ng；定量限分别为36、30、30、32 和36 ng。

表3 线性关系及校正因子

2.6精密度试验 取“2.2.1”项下醋酸曲普瑞林对照品溶液以及“2.2.2”项下系统适用性溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，重复进样分析6 次。结果曲普瑞林、D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林峰面积的RSD分别为0.3%、0.6%、0.4%、0.7%和0.7%，表明该方法重复性良好。

2.7重复性试验 取样品1平行6份，按照“2.2.3”项下的方法制备成供试品溶液，依照“2.1”项下的色谱条件测定D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林含量。结果6份供试品中均未检出D-丝氨酸4-曲普瑞林和D-亮氨酸7-曲普瑞林，D-酪氨酸5-曲普瑞林含量的平均值为0.066%,RSD值为1.7%；游离酸含量的平均值为0.19%，RSD值为1.1%，表明重复性良好。

2.8稳定性试验 取“2.2.2”项下系统适用性溶液在室温下放置0、12和24 h 后分别进样，考查溶液稳定性。结果24 h内系统适用性溶液中D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林峰面积的RSD分别为1.2%、0.8%、0.6%和1.0%，保留时间的RSD分别为0.1%、0.3%、0.5%和0.3%，表明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.9回收率试验 精密称取已测得杂质含量的样品1约90 mg置25 ml量瓶中，平行配制9份，精密加入D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-亮氨酸7-曲普瑞林杂质对照品贮备溶液(约0.1 mg/ml)4、5和6 ml，每个浓度平行3份；精密加入D-酪氨酸5-曲普瑞林杂质对照品贮备溶液(约0.1 mg/ml)0.6、0.8和1 ml,游离酸杂质对照品贮备溶液(约0.1 mg/ml)1.7、2.1和2.5 ml，使加入对照品的量与样品中原有量之比约为0.8∶1、1∶1和1.2∶1，每个浓度平行3份，然后用0.1%磷酸溶液稀释定容至刻度，精密量取10 μl进样测定，以测得量与加入量之比计算回收率。结果D-丝氨酸4-曲普瑞林、D-酪氨酸5-曲普瑞林、游离酸和D-亮氨酸7-曲普瑞林平均回收率分别为100.3%、99.1%、98.4%和99.0%，RSD分别为1.1%、1.6% 、1.2%和1.0%。4个杂质的回收率数据见表4-7。

表4 D-丝氨酸4-曲普瑞林回收率试验结果(n=9)

表5 D-酪氨酸5-曲普瑞林回收率试验结果(n=9)

表6 游离酸回收率试验结果(n=9)

表7 D-亮氨酸7-曲普瑞林回收率试验结果(n=9)

2.10样品测定 取“2.2.3”项下供试品溶液1、2、3，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，记录色谱图，外标法计算各有关物质含量，结果见表8。

表8 3批样品中有关物质测定结果

注：“-”代表未检出

3 讨论

现行2015年版《中国药典》对于醋酸曲普瑞林有关物质的检查方法采用的是等度色谱方法，对于主成分与游离酸之间的分离度作出了要求，却并未规定杂质间分离度要求。现行《中国药典》有关物质分析方法对于瑞士Bachem AG公司所生产的醋酸曲普瑞林适用性并不理想，所以针对Bachem AG公司产品的实际情况重新建立醋酸曲普瑞林有关物质的HPLC分析测定方法。

在系统适用性试验过程中发现新建立的色谱条件中乙腈比例变化对于醋酸曲普瑞林及其有关物质的保留时间和分离度存在显著影响，同时温度对于各物质间的分离度也有一定的影响。在最终新建立的梯度色谱条件下，各成分间达到比较理想的分离，但此系统条件的缺点是各成分保留时间均较大，分析时间长。

本试验对已知杂质与曲普瑞林之间的响应因子也进行了考查，证实了醋酸曲普瑞林有关物质检查过程中采用主成分外标法的合理性。

本试验过程中新建立的HPLC方法能够同时准确方便地测定醋酸曲谱瑞林中多种有关物质，为醋酸曲普瑞林的质量控制提供检测依据。