生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸的协同给药研究*

胡祥龙，翟少东，张文佳，曹　冰，杨　军

（1.华南师范大学激光生命科学研究所，激光生命科学教育部重点实验室，生物光子学研究院，广东广州510631）

生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸的协同给药研究*

胡祥龙，翟少东，张文佳，曹冰，杨军

（1.华南师范大学激光生命科学研究所，激光生命科学教育部重点实验室，生物光子学研究院，广东广州510631）

肿瘤单一药物治疗的效果往往不佳，且易产生耐药性，因此，肿瘤的多药协同治疗具有明显优势，并逐渐引起重视。本工作基于具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-b-PLA）两嵌段聚合物，物理包埋两种化疗药物，阿霉素（Doxorubicin，DOX）和喜树碱（Camptothecin，CPT），实现两种化疗药物的共传输、药物释放与协同给药，表现出良好的抗肿瘤活性。

聚乙二醇-嵌段-聚乳酸；生物可降解性；药物释放；协同给药

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.009

0　引言

通过在传统药物系统中混合负载多种药物实现复杂疾病的系统治疗，相对于单一药物治疗，是一种方便，有效的手段［1，2］。近年来众多载药体系被用于多药传输，如无机二氧化钛纳米管［3］、两亲性小分子胶束等［4］。其中，医用高分子的载药体系研究越来越引起关注，相对于无机材料，其具有良好的生物可降解性和生物相容性；相对于小分子表面活性剂，高分子载药体系具有更好的稳定性、易功能化和良好的药代动力学特征［5-9］。聚乳酸（PLA）和聚乙二醇（PEG）分别作为合成高分子的典型代表已被广泛用作药物载体，其安全性已经通过美国FDA认证。其中，PEG功能化PLA嵌段共聚物能够有效地调控载体的亲疏水性、药物释放速率和载药率，延长药物在血液中的循环时间、加强药物靶向给药能力［10］；其胶束内核可以同时负载多种疏水化疗药物，因此有望进一步用于多药的共传输与协同给药。

本工作中，我们采用聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-b-PLA）为生物可降解载体，同时包埋两种具有协同作用的抗肿瘤化疗药物阿霉素（DOX）和喜树碱（CPT），可以很好地实现两种协同化疗药物的共传输，表现出良好的协同抗肿瘤活性。

1　实验部分

1.1试剂

聚乙二醇单甲醚（PEG45-OH，Mn=2.0 kDa，Mw/Mn=1.06），喜树碱（camptothecin，CPT），阿霉素（doxorubicin hydrochloride，Dox·HCl）和辛酸亚锡等均采购自Sigma-Aldrich公司，直接使用。无水乙醚，四氢呋喃，二氯甲烷，甲苯等溶剂均购自国药集团，甲苯使用前经干燥蒸馏处理。

1.2仪器与表征

核磁共振谱（NMR）采用Bruker AV300核磁共振仪表征（共振频率为300 MHz，CDCl3为氘代试剂）。透射电子显微镜（TEM）测试在JEOL 2010电子显微镜完成，加速电压120 kV，样品制备时，吸取10 μL样品溶液滴在Formvar薄膜和碳膜的铜网上，然后快速液氮冷却，冷冻干燥以保持其在溶液态的形貌。水相中纳米粒子的尺寸采用Malvern Nano ZS表征。紫外-可见光谱利用Unico UV/vis 2802PCS紫外可见分光光度计测试。

2　结果与讨论

2.1生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30的合成

将单甲基聚乙二醇（2 g，1 mmoL）和丙交酯（7.21 g，50 mmoL）溶于50 mL干燥甲苯中，减压除去大部分甲苯；在氮气保护下，加入催化量辛酸亚锡；再减压抽去部分甲苯，封闭体系，在100℃下反应12 h，用液氮终止反应，用四氢呋喃稀释，无水乙醚沉淀，反复溶解、沉淀三次，经室温干燥过夜，得到白色固体（7.8 g，产率为76.3%），其核磁共振氢谱表征如Fig.1所示，经过对比计算聚乙二醇主链中亚甲基质子在3.65 ppm处的积分面积与聚乳酸主链上的甲基质子在1.56 ppm处的积分面积，得到PLA的聚合度为30，其分子式表示为PEG45-b-PLA30。

2.2双药物负载的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸胶束纳米粒子的制备与表征

由于PEG45-b-PLA30中聚乙二醇亲水链的存在，因此其具有两亲性。本文采用“自下而上”的自组装策略来制备负载双药物的PEG45-b-PLA30胶束纳米粒子，先分别称取5.0 mg PEG45-b-PLA30，1 mg喜树碱，1 mg阿霉素溶解在1.0 mL DMSO中，再加入50 μL三乙胺使阿霉素盐酸盐去质子化，常温搅拌溶解1 h；随后将其快速注入达到快速搅拌的去离子水中，持续搅拌3 h，然后转移到透析袋中对水透析，除去有机溶剂，多次换水，即可制备包埋两种药物的胶束纳米粒子，进行浓度标定，并用于后续测试。

采用粒度仪对该载药胶束在水相中的尺寸进行了表征，如Fig.2a所示，纳米粒子的平均直径约为53 nm，分布较窄，抗肿瘤药物传输纳米粒子的尺寸一般不超过200 nm会更加有利，因此，本体系中包埋两种药物的纳米载体的尺寸满足肿瘤治疗的要求。如Fig.2b所示，采用透射电镜（TEM）进一步表征了该载药胶束系统干态下的尺寸与分布，直径约为42 nm，略小于水相中的尺寸，这是由于在干态下的TEM测试中，外围的PEG亲水链是无法辨识的，造成粒径略小的现象。另外，基于标准曲线法，测定了该载药胶束系统对阿霉素和喜树碱的载药量分别达到8. 2%和10.6%。

图1　生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30分子结构及其核磁共振氢谱表征Fig.1　Chemical structure and 1H NMR spectrum of PEG45-b-PLA30diblock copolymer

图2　聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30负载阿霉素和喜树碱药物的胶束表征：（a）流体力学尺寸（DLS）分析；（b）透射电镜（TEM）表征Fig.2　（a）Hydrodynamic diameter distributions，＜Dh＞，and（b）TEM image recorded for CPT and DOX co-loaded polymeric micelles fabricated from PEG45-b-PLA30diblock copolymer

图3　包埋阿霉素和喜树碱的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸双药物系统的体外药物释放曲线Fig.3　DOX and CPT release profiles recorded for CPT and DOX co-loaded polymeric micelles fabricated from PEG45-b-PLA30upon incubation with PBS buffer at pH 7.4

2.3药物释放评价

取200 μL 0.1 g/L的载药胶束装入透析管中，然后将该透析管浸入磷酸盐（PBS）缓冲液中，设定条件为pH 7.4，温度37℃，定时取10 mL透析液测试，并补充等体积的新鲜缓冲液到试剂瓶中。采用紫外分光光度计定量药物释放的速率。如Fig.3所示，得到阿霉素和喜树碱的体外药物释放曲线，在生理条件下孵育24 h，阿霉素和喜树碱的累计释放量分别达到43%和36%，因此，被包埋在胶束疏水内核的两种化疗药物均可以释放出来，而且具有良好的可控性特征。

2.4抗肿瘤活性评价

本工作中，我们选用HepG2细胞系，利用MTT法评价了该载药胶束的抗肿瘤活性。首先将HepG2细胞接种到96孔板上，每个孔添加100 μL培养基，初始密度约为每孔80 000个细胞，培养过夜至细胞贴壁，再用换取新鲜的培养基替代，分别加入空白胶束、小分子抗癌药物阿霉素、喜树碱或载药的胶束，共培养48 h。另设细胞空白对照组和培养基空白组，每孔设5复孔。每孔加入20 μL MTT试剂（PBS溶液，5 mg/mL-1），继续培养5 h后，吸出DMEM培养基，加入180 μL DMSO，酶标仪检测570 nm的吸光度值（A）。每次实验条件均采集四组数据，所得到的最终数据是四组平行试验的平均值及标准偏差（±SD），以培养基空白组调零，计算细胞存活率。如Fig.4a所示，PEG45-b-PLA30空白胶束具有很好的生物相容性，聚合物浓度达到300 μg/mL的情况下，其存活率仍然高于80%；另外，已有报道表明阿霉素和喜树碱对多种肿瘤具有较好的协同抑杀作用［11，12］，本文也研究了负载有两种药物胶束的细胞毒性并与小分子抗癌药物对比，如Fig.4a所示，负载有两种药物的胶束系统比单一小分子抗癌药物具有更高的抗肿瘤活性，从而说明本体系中的协同给药功能具有明显的优势，表现出良好的抗肿瘤活性。

3　结论

近年来，多药传输被用于抗肿瘤研究越来越受到关注，且基于生物可降解高分子的多药协同传输体系更具有优势。本文利用具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸作为载体，同时物理负载两种化疗药物，阿霉素和喜树碱，制备了分布较均匀的球形纳米粒子。细胞生物学评价表明，该双载药胶束系统对HepG2细胞实现了协同给药，具有较好的抑杀效果。本文研究表明，生物可降解高分子聚乙二醇-嵌段-聚乳酸在肿瘤的多药协同传输、协同给药领域具有良好的应用前景。

图4　（a）聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30的空白胶束溶液与HepG2细胞共培养48 h的细胞活性；（b）包埋阿霉素和喜树碱的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸胶束溶液与HepG2细胞共培养48 h的细胞毒性评价Fig.4　Cell viability determined by MTT assay for HepG2 cells upon incubation 48 h with aqueous dispersion of（a）blank micelles of PEG45-b-PLA30diblock copolymer，and（b）CPT and DOX co-loaded polymeric micelles of PEG45-b-PLA30at varying equivalent drug concentrations

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Synergetic Drug Treatment Based on Biodegradable Poly（ethylene glycol）-b-Poly（lactic acid）Nanocarriers

HU Xianglong，ZHAI Shaodong，ZHANG Wenjia，CAO Bing，YANG Jun
（1.MOE Key Laboratory Laser Life Science&Institute of Laser Life Science，College of Biophotonics，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China）

The therapeutic efficiency of tumors upon treating with single drug is usually unsatisfactory，which would probably result in drug resistance.Hence，the multi-drug synergetic therapy against tumors has exhibited some advantages and attracted attention gradually.In the current work，biocompatible and biodegradable poly（ethylene glycol）-b-poly（lactic acid），（PEG-b-PLA），was employed to encapsulate two types of anticancer drug，doxorubicin（DOX）and camptothecin（CPT）.It was demonstrated that dual drug delivery，release，and synergetic drug treatment was realized in the nanocarrier，exhibiting good anticancer activity.

poly（ethylene glycol）-b-Poly（lactic acid）；biodegradability；drug release；synergetic drug treatment

Q225

A

1007-7146（2015）04-0354-04

2015-05-26；

2015-06-12

国家自然科学基金项目（51403042）；广东省自然科学基金项目（2014A030310310）

胡祥龙（1984-），男，汉族，安徽六安人，华南师范大学讲师，博士，主要从事生物医用高分子研究。（电话）020-85211436；（电子邮箱）xlhu@scnu.edu.cn