茶鲜叶萎凋过程中游离氨基酸的动态变化规律

宋振硕，王丽丽，陈键，杨军国，张应根，陈林（福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

茶鲜叶萎凋过程中游离氨基酸的动态变化规律

宋振硕，王丽丽，陈键，杨军国，张应根，陈林*
（福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

萎凋是影响白茶、红茶和乌龙茶风味品质的重要工序。本文选用10份茶树品种春茶新梢的一芽二、三叶和中小开面二至四叶为供试材料，在控温控湿（20～22℃、RH 35%～45%）条件下，探讨了不同萎凋程度茶鲜叶的游离氨基酸动态变化规律。结果表明，供试茶样可按嫩度划分为两个类群，且在萎凋过程中均有按鲜叶减重率（0%、15%、30%、45%、60%）区分倾向，而使之区分的游离氨基酸特征组分主要有茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸和丝氨酸。随着萎凋程度（鲜叶减重率）的加重，尤其是在减重率 30%以后，一芽二、三叶和中小开面二至四叶茶样在二维空间的分布渐趋离散，即不同品种茶样中游离氨基酸的组成模式愈加多样。茶鲜叶各游离氨基酸在萎凋过程中的组分变化差异明显，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等游离氨基酸含量呈增加趋势，而茶氨酸含量逐渐减少。该研究结果可为基于萎凋工艺的茶叶品质控制提供参考依据。

茶鲜叶；萎凋；游离氨基酸；主成分分析

萎凋是白茶品质形成的主要特征工序，也是红茶和乌龙茶等多种茶类加工的初始工序。伴随萎凋过程水分的逐步散失，茶鲜叶的生理结构和理化特性将发生一系列复杂变化，并直接或间接影响茶叶的后续加工和制茶品质［1-2］。游离氨基酸作为构成茶叶品质的重要成分，其组成、含量以及它们的降解产物和转化产物均会影响茶叶品质［3］。茶叶加工过程中，氨基酸不仅可以形成茶汤的鲜爽味，还可以通过脱氨反应、脱羧反应、美拉德反应等产生各种醇类和醛类香气物质［4-5］。茶鲜叶萎凋过程中温度、湿度等环境条件是重要的影响因素，影响水分的散失速度、内含物化学反应的进度和程度，并最终影响风味品质成分的组成和含量［6-8］。自然条件下萎凋易受温度、湿度的影响，导致其结果存在不确定性。为揭示茶鲜叶萎凋过程中游离氨基酸的变化规律，本研究借助空调、除湿机等设备进行萎凋环境条件的设置，准确调控萎凋温、湿度条件下，选用10份茶树品种的春茶新梢为供试原料，对两种不同采摘嫩度茶鲜叶的萎凋失水情况进行了跟踪监测，并根据其萎凋减重率变化进行取样固样，采用高效液相色谱法检测分析18种游离氨基酸组分含量，明确萎凋过程中游离氨基酸组分的动态变化，以期为系统研究基于茶鲜叶萎凋失水管理的茶叶生化成分变化提供参考依据，对改进萎凋工艺提高茶叶品质具有较好的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜叶原料均采自福建省农业科学院茶叶研究所试验茶园，采摘标准为春茶新梢一芽二、三叶和中小开面二至四叶。供试茶树品种10份，分别是黄棪、梅占、白芽奇兰、佛手、茗科1号（金观音）、黄观音、福建水仙、肉桂、大红袍和矮脚乌龙。

Agilent Zorbax Eclipse-AAA HPLC柱、硼酸缓冲液、OPA试剂、氨基酸标准液［含有天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys），美国Agilent公司］，茶氨酸（99%，瑞士Adamas Reagent公司），γ-氨基丁酸（99%，美国sigma-aldrich公司），NaH2PO4、NaOH（分析纯，上海国药集团），甲醇、乙腈（色谱纯，美国sigma-aldrich公司），超纯水（自制）。

1.2 主要仪器设备

色谱系统（美国Agilent公司）：Agilent 1260 高效液相色谱仪，配有G1311C四元泵、G1315D二极管阵列检测器（DAD）；化学工作站：Agilent ChemStation B.04.03 ［52］。PB-21 标准型pH计（德国sartorius公司）；AL204电子天平（美国梅特勒-托利多集团）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；ACD-0502-U 实验室超纯水系统（美国艾科浦国际有限公司），KF-35GW/35356格力空调（珠海格力电器股份有限公司），ROBO60T工业电热风机（上海固途工业品销售有限公司），CH150D转轮式除湿机（广州市森井贸易有限公司），S520-EX温湿度记录仪（深圳市华图测控系统有限公司），HAW-15AB计重电子天平（福州衡之展电子有限公司），G80F23CN2L-Q6（R0）格兰仕微波炉（广东格兰仕集团有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 供试样品制备

称取茶鲜叶250 g，对其在控温控湿（20～22℃、RH 35%～45%）环境条件下的萎凋失水变化进行定时计量（每隔3 h称重1次），计算萎凋叶的萎凋减重率，直至减重率达到约60%为止；对茶鲜叶（减重率0%）和萎凋叶（减重率为15%、30%、45%和60%）进行微波［功率×时间：P-HI（火力）×60 s］、烘干（80℃、2 h）固样。按照茶水比1 ： 150准确称取茶样和量取纯水于刻度试管中，沸水浴浸提60 min （30 min时摇动1次），浸提完毕后冷却，摇匀过滤茶渣，然后过0.45 μm水膜待测。

1.3.2 色谱分析条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；柱温：40℃；流动相：40 mM Na2HPO4pH7.8（A相）和ACN（乙腈）：MeOH（甲醇）：水（v/v/v）为45 ： 45 ： 10溶液（B相）线性梯度洗脱，洗脱程序：100%A（0 min）→100%A（1.9 min）→43%A（18.1 min）→0%A（18.6 min）→0%A（22.3 min）→100%A（23.2 min）→100%A（26 min），流速2 mL·min-1；DAD检测波长338 nm；自动在线衍生化进样程序：吸取2.5 μL硼酸缓冲液→吸取0.5 μL样品，混合，等待0.5 min→清洗针头→吸取0.5 μL OPA，混合→清洗针头→吸取32.5 μL水，混合→进样。

1.3.3 标准品溶液制备与标准曲线制作

准确称取0.200 g茶氨酸，置于10 mL容量瓶中加水定容，得浓度为20 mg·mL-1标准储备溶液；准确称取γ-氨基丁酸0.020 g，置于10 mL容量瓶中加水定容，得浓度为2 mg·mL-1的标准储备溶液；分别吸取1 μL茶氨酸和1 μLγ-氨基丁酸标准储备液加入到100 μL的氨基酸标准液（250 pmol·mL-1）制得母液，然后对母液稀释成25 pmol·mL-1、50 pmol·mL-1、125 pmol·mL-1、250 pmol·mL-14个浓度梯度，得到系列标准工作液。取标准工作液，经自动在线衍生化后进液相色谱分析，使用 Agilent ChemStation B.04.03 ［52］对各色谱峰进行积分，获得各峰的峰面积，以各种氨基酸峰面积为纵坐标，氨基酸进样浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程和相关系数R2值。

1.3.4 数据统计分析

实验数据经标准化预处理后（公式 1）采用Multibase进行主成分分析；采用SPSS 21.0对实验数据进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸色谱图分离效果与线性关系考察

在1.3.2中色谱分析条件下，对氨基酸混合标样（50 pmol·mL-1）与茶样（以矮脚乌龙一芽二、三叶为代表）进样分析，同时测定18种游离氨基酸（见图1）。从图1中可以看出，整个分析运行过程只需16 min，可以实现游离氨基酸的快速测定，分离的色谱峰峰型好，分辨率高。对氨基酸混合标样的系列标准工作液进样分析，建立了18种氨基酸标准曲线方程（见表1）。从表1中可以看出，相关系数R2值均在0.9956～0.9999之间，在25～250 pmol·mL-1的浓度范围内，各种氨基酸的进样浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.2 供试茶样中基于游离氨基酸组分的主成分分析

供试茶样中游离氨基酸组分含量数据经标准化预处理后进行主成分分析（图2）。从图中可以看出，供试茶样基本上可以划分为一芽二、三叶和中小开面二至四叶两个类群，可较好的进行两种不同嫩度区分，一芽二、三叶茶样在二维空间的分布相对较为集中，而中小开面二至四叶茶样则较为分散，表明不同嫩度茶鲜叶中的游离氨基酸组分存在差异。从主成分分析结果（表 2）可以看出，两种采摘嫩度的茶样类群划分主要依据前3个主成分，其方差贡献度分别为 85.8%（PC1）、4.6%（PC2）、3.6% （PC3），PC1主要与Thea、Asp、Glu等有关，PC2主要与Lys、Phe、Arg等有关，而PC3主要与Thea、Arg、Ser等有关。对这3个主成分的特征向量进行加权平均综合分析，一芽二、三叶区别于中小开面二至四叶的游离氨基酸特征组分主要是Thea、Asp、Glu、Arg、Thr和Ser，其权重累积达到83.1%。

图 1 氨基酸标准混合样和代表性茶样的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms on amino acids of composited standard and tea extracts

表1 氨基酸标准曲线方程Table 1 Curve of amino acids standard

表2 主成分分析结果Table 2 Results of principal component analysis shown in Fig. 2

图 2 供试茶样基于游离氨基酸组分的主成分分析Fig. 2 Principal component analysis based on free amino acids in teas

图 3 一芽二、三叶茶样基于游离氨基酸组分的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis based on free amino acids in teas made from a bud， 2ndand 3rdleaves

供试茶样中游离氨基酸组分含量按两种采摘嫩度分别数据标准化预处理再进行主成分分析（图3、4）。从图3中可以看出，一芽二、三叶茶样在萎凋过程中主体呈单向展开趋势，有按减重率（0%、15%、30%、45%、60%）区分倾向。从主成分分析结果（表3）可以看出，可用2个主成分来刻划，方差贡献度为86.5%（PC1）和4.2%（PC2），PC1主要与Thea、Asp、Glu等有关，PC2主要与Val、Lys、Thea等有关。对这2个主成分的特征向量进行加权平均综合分析，使一芽二、三叶茶样按减重率相互区分的游离氨基酸特征组分主要是 Thea、Asp、Glu、Arg、Thr和Ser，其权重累积达到77.9%。

中小开面二至四叶茶样在萎凋过程中主体也呈单向展开趋势，有按减重率区分倾向（图4）。从主成分分析结果（表4）可以看出，可用3个主成分来刻划，方差贡献度为82.8%（PC1）、5.8%（PC2）和5.1%（PC3），PC1主要与Thea、Asp、Glu等有关，PC2主要与Lys、Phe、Arg等有关，而PC3主要与Leu、Thea、Val等有关。对这3个主成分的特征向量进行加权平均综合分析，使中小开面二至四叶茶样按减重率相互区分的游离氨基酸特征组分主要是Thea、Asp、Glu、Arg、Ser和Val，其权重累积达到80.9%。

随着萎凋程度的加重，尤其是在减重率30%以后，一芽二、三叶和中小开面二至四叶茶样在二维空间的分布都是越来越分散，不同品种茶样中游离氨基酸组分含量的差异越来越大。

表3 主成分分析结果Table 3 Results of principal component analysis shown in Fig. 3

表4 主成分分析结果Table 4 Results of principal component analysis shown in Fig. 4

图 4 中小开面二至四叶茶样基于游离氨基酸组分的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis based on free amino acids in teas made from 2ndto 4thleaves on a banjhi bud

2.3 供试茶样萎凋过程中游离氨基酸的动态变化

在控温控湿萎凋过程中，萎凋叶中的游离氨基酸含量（以干质量计）发生了显著的变化（表5）。一芽二、三叶茶鲜叶萎凋过程中，游离氨基酸总量在萎凋减重率到45%时显著增加，继续萎凋至减重率到60%时略有减少；Thea含量呈减少趋势，变化差异不显著；Asp、Glu等游离氨基酸含量呈增加趋势，Asp、His等变化差异不显著，而Glu、Ser等游离氨基酸含量显著增加，Glu在萎凋减重率到60%时又明显减少；Val、Phe等在茶鲜叶中未检出，而在萎凋过程中显著增加。中小开面二至四叶茶鲜叶萎凋过程中，游离氨基酸总量呈增加趋势，变化差异不显著；Thea含量也呈减少趋势，变化差异不显著；Asp、Glu等游离氨基酸含量呈增加趋势，变化差异不显著，而含量相对较少的Ser、Thr等游离氨基酸含量显著增加；Val、Phe等在茶鲜叶中未检出，而在萎凋过程中显著增加。两种不同嫩度茶鲜叶在萎凋过程中，Thea、Glu等游离氨基酸变化趋势基本一致，Tyr在一芽二、三叶茶鲜叶萎凋过程中呈减少趋势，变化差异不显著，在中小开面二至四叶中未检出，而Leu在一芽二、三叶茶鲜叶萎凋过程中始终未检出，在中小开面二至四叶茶鲜叶中未检出，在萎凋过程中显著增加。

由此可见，随着萎凋程度的加重，萎凋叶中游离氨基酸含量变化差异明显，Asp、Glu、Ser等多数游离氨基酸含量呈增加的趋势，而Thea含量逐渐减少。

表5 茶鲜叶萎凋过程中游离氨基酸的变化Table 5 Changes on free amino acids in teas during withering（mg·g-1）

3 讨论

多变量数据集在进行主成分分析之前，常需要对数据进行适当权重/转换。如果直接采用主成分分析这种最大化差异投影的方法，往往造成绝对数值大、变异较大的变量在模型拟合中的贡献占主导地位，而绝对数值范围小、变异小的变量对模型的贡献也小。为了消除这种偏重，可以对数据进行合理的权重或缩放［9］。主成分分析有多种权重方法，但是有关茶叶多种化学成分的数据预处理和模式识别目前尚无可靠的计量标准［10］。本文经对比后使用数据未中心化的标准差标准化预处理方法，然后进行主成分分析，可使后续视图分类更为有效。

茶鲜叶在萎凋过程中，叶细胞组织逐步失水，细胞膜透性及相关酶活性增强，鲜叶中内含成分发生水解、氧化，一些复杂的大分子贮藏物质和部分结构物质分解成简单的小分子物质［11］。本文的萎凋过程中，游离氨基酸总量整体上呈上升趋势，各游离氨基酸组分间变化差异明显，Asp、Glu、Ser等主要游离氨基酸含量趋于增加，期间也会出现波动性减少，滑金杰等［8］的研究中整个萎凋过程中氨基酸总量缓慢上升，而在20℃萎凋过程中氨基酸总量也会出现一段下降的变化过程，主要因为茶鲜叶在萎凋过程中，不仅发生蛋白质、多肽在蛋白酶和肽酶的作用下水解生成游离氨基酸［12］，而且游离氨基酸也被邻醌氧化产生各种醇类和醛类香气物质［13］，游离氨基酸的增减主要依据在不同的加工阶段哪种变化起主导作用。茶氨酸作为一种茶树特征性非蛋白主体氨基酸在萎凋过程中呈逐渐减少趋势，变化差异不显著，可能是茶氨酸在水解酶的作用下发生了分解。萎凋过程中各游离氨基酸组分的增减变化相关性、其它生化成分的变化以及萎凋工艺如何控制还有待进一步研究。

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Changes on Free Amino Acids in Fresh Tea Leaves during Withering

SONG Zhen-shuo，WANG Li-li，CHEN Jian，YANG Jun-guo，ZHANG Ying-gen，CHEN Lin*
（Tea Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fu'an， Fujian 355015， China）

Withering in tea processing significantly affects the flavor of white， black and oolong teas. The spring shoots （i.e.， a bud，2ndand 3rdleaves， or 2ndto 4thleaves on a banjhi bud） harvested from 10 tea cultivars were used in the experimentation. The withering chamber was controlled at 20～22℃ and 35%～45% RH. The changes on free amino acid contents in the tea leaves at various withering stages were monitored. The results showed that the leaf samples could be classified into two groups based on the maturity of the shoots. All teas prepared could be differentiated by their weight losses （i.e.， 0%， 15%， 30%， 45% and 60%） at different stages of withering. As the leaf weight decreased， changes were apparent on the typical free amino acids found in teas，including Thea， Asp， Glu， Arg， Thr， and Ser. Especially after the leaves lost 30% of their original fresh weight， the tea samples showed a significant spreading on the 2ndorder dimension distribution， indicating diversified amino acid compositions among different varieties of the teas during withering. There appeared a trend in increasing the contents of Asp， Glu and Ser， and declining in that of Thea as the withering progressed.

fresh tea leaves； withering； free amino acids； principal component analysis

TS272.7

A

2015-10-27初稿；2015-12-07修改稿

福建省农业科学院科技创新团队项目（CXTD-1-1302）；福建省自然科学基金（2014J01097）；福建省属公益类科研院所基本科研专项（2014R1012-8）。

宋振硕（1984-），男，硕士，助理研究员，主要从事茶叶生物化学与综合利用研究。E-mail： 274719459@qq.com

陈林（1975-），男，博士，副研究员，主要从事茶叶加工、茶叶生物化学及综合利用研究。E-mail： chenlin_xy@163.com