miR-451在胃癌组织中的表达及其临床意义

陈涛，谢黎明，唐海林

临床研究

miR-451在胃癌组织中的表达及其临床意义

陈涛，谢黎明，唐海林

目的研究miR-451在胃癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法收集胃癌组织标本92例，癌旁正常组织47例，制成组织芯片。采用原位杂交技术检测胃癌组织及癌旁组织中miR-451的表达情况，分析miR-451在胃癌组织中的表达水平与胃癌患者临床病理参数以及预后的关系。结果miR-451在胃癌组织中的高表达率比癌旁正常胃黏膜组织明显降低（38.04%vs 76.60%，χ2=18.503，P＜0.001）。Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者miR-451的高表达率低于Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者（27.3%vs 54.1%，P=0.009），有淋巴结转移胃癌组织中miR-451的高表达率亦低于无淋巴结转移者（27.1%vs 57.6%，P=0.004），而不同年龄、性别、组织分化程度、T分期患者间miR-451高表达率差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-451高表达者总生存率明显高于低表达者（69.2%vs 39.1%，P=0.003）。结论miR-451与胃癌的恶性转变、浸润转移以及预后明显相关，可能是胃癌新的潜在诊断和预后分子标志物及治疗靶点。

胃肿瘤；癌；预后；基因表达；原位杂交；miR-451

miRNA是一类长20～23 nt的单链非编码RNA，通过与靶基因3′非编码区完全或不完全结合，从而抑制靶基因的翻译或导致mRNA的降解而发挥调控基因表达的功能［1］。目前，在人类共发现有2 000多种成熟的miRNA，已证实miRNA参与多种重要生物学过程的调控，如发育、增殖、分化、凋亡，并且还参与多种恶性肿瘤的发生发展［2］。研究显示miR-451在肿瘤中表达下调并类似于抑癌基因样作用［3］。然而，目前对miR-451在胃癌中的表达及临床意义的研究报道尚少。本研究通过原位杂交技术检测miR-451在胃癌组织与癌旁正常胃黏膜组织中的表达，探讨miR-451与胃癌临床分期、转移、预后等的关系，为进一步揭示胃癌发病机制并寻找新的诊断及预后分子标志物提供实验依据。

1　材料与方法

1.1标本收集组织标本来源于2005年3月—2011年9月南华大学第一附属医院资源库保存的胃癌石蜡标本92例，癌旁正常组织标本47例，制成组织芯片。患者年龄31～78岁，平均（55±18）岁。术前均未做化疗或放疗等抗肿瘤治疗。所有配对标本癌组织经HE染色证实均为腺癌，所取正常组织距癌缘＞5 cm，HE染色证实为非癌组织，均无肠上皮化生或上皮内瘤变。

1.2仪器与试剂杂交炉购自英国HYBRID公司，恒温水浴箱购自美国Pharmacia公司，原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司，miRNA-451探针序列由美国Exiqon公司合成。

1.3方法

1.3.1miR-451表达的检测采用原位杂交法。烤片后切片常规脱蜡，梯度乙醇复水。3%过氧化氢灭活内源性酶。3%胃蛋白酶室温消化15～20 min，水洗后固定。滴加预杂交液，55℃预杂交2 h。地高辛标记的miR-451探针55℃杂交过夜。次日用不同浓度SSC缓冲液洗涤。滴加封闭液室温封闭30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛室温孵育2 h。滴加SABC液室温孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，充分水洗，中性树胶封片保存。

1.3.2结果判定miR-1451呈棕黄色颗粒的阳性信号定位于胃黏膜上皮或胃癌细胞胞质和胞核中。对miR-451的信号强度进行评估并赋予分值（0～4分）：0～≤1分为无，＞1～≤2分为弱信号，＞2～≤3分为中等信号，＞3～≤4分为强信号［1］。每个标本于400倍显微镜分别选取3个具有代表性的视野计数阳性细胞并计算miR-451阳性细胞所占百分比。表达得分等于信号强度×阳性细胞的百分比，最低为0，最大为4，＜2为低表达，≥2为高表达。组织芯片结果由2位病理医师独立镜检和评分。

1.4统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验或确切概率法。采用Kaplan-Meier生存曲线分析miR-451表达水平与胃癌患者预后的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胃癌组织中miR-451表达水平92例胃癌组织中miR-451低表达57例（61.96%），高表达35例（38.04%）；47例正常胃黏膜组织中miR-451低表达11例（23.40%），高表达36例（76.60%），差异有统计学意义（χ2=18.503，P＜0.001）。染色情况见图1。

2.2miR-451在胃癌组织中的表达与临床病理参数之间的关系TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者miR-451的高表达率明显低于Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者（P= 0.009）。有淋巴结转移的胃癌组织中miR-451的高表达率亦低于无淋巴结转移者（P=0.004）。而不同年龄、性别、组织分化程度、T分期患者间miR-451高表达率差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3miR-451在胃癌组织中表达水平与预后的关系对92例胃癌患者的亲属进行电话随访，随访4～42个月。Kaplan-Meier分析发现，57例低表达者中死亡28例，病死率60.9%，而35例高表达者中死亡8例，病死率30.8%。生存分析显示，miR-451高表达者总的生存率（69.2%）明显高于低表达者（39.1%），表明miR-451表达越高的胃癌患者，其生存时间越长，预后越好（log-rank χ2=8.856，P= 0.003），见图2。

Tab.1　The correlation between expression of miR-451 and its clinicopathologic parameters in patients with gastric cancer表1　胃癌患者miR-451高表达水平与临床病理参数之间的关系　例（%）

Fig.2　Survival curve of miR-451 expression and clinical prognosis of patients with gastric cancer图2　miR-451表达与胃癌患者预后的生存曲线

3　讨论

3.1miRNA在胃癌发生发展中的可能机制胃癌的发生是一个多因素、多阶段、多步骤的病理发展过程，涉及一系列相关癌基因和抑癌基因的参与。近年来，miRNA成为分子生物学的研究热点。miRNA在不同类型的肿瘤中表达各异，而且表达异常的miRNA往往位于癌症相关基因的突变位点。目前研究显示影响miRNA在胃癌中表达异常的可能机制有：参与miRNA形成的蛋白因子异常［4］、DNA甲基化的状态［5］以及miRNA所在基因发生缺失、扩增、转位［6］等。

3.2miRNA在胃癌中表达的临床意义胃癌中有多种miRNA的表达，且不同表达水平患者的预后亦不同。Li等［7］对100例胃癌患者的miRNA表达谱检测分析发现，在胃癌中let-7a、miR-10b、miR-126、miR-223、miR-21、miR-30a-5p、miR-338的表达可作为一个独立的预测因子用于预测患者的总生存期和无病生存时间。Zhang等［8］研究显示，在胃癌中miR-375高表达以及miR-142-5p低表达能预测胃癌患者的术后复发率。研究表明，miR-200b和miR-200c在胃癌中低表达，且与胃癌患者的总生存期和无病生存时间相关，并且可能是一个能独立预测胃癌患者生存的因子［1］，且miR-200b能抑制胶质细胞瘤的增殖和侵袭［9］。还有研究发现miR-200b 和miR-22在胃癌中低表达，并与胃癌患者的临床分期和淋巴结转移呈负相关［10］。

3.3miR-451在胃癌中表达的临床意义研究表明，miR-451在肺癌［3］、肝癌［11］、食管癌［12］、胶质瘤［13］、鼻咽癌［14］中表达下调，类似于抑癌基因样作用抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，表明miR-451在这些肿瘤的发生发展过程中可能发挥重要作用。Liu等［15］通过将miR-451模拟物转染至结肠癌RKO株和宫颈癌Hela细胞株中，发现这两种细胞的增殖和侵袭能力明显受到抑制，而将miR-451模拟物转染至人脐静脉内皮细胞（HUVEC）株中，该细胞的血管生成能力明显下降，表明miR-451能抑制肿廇细胞的增殖、侵袭和血管生成能力。汪伟等［16］通过对18例胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织进行研究显示，miR-451在胃癌组织中的表达与胃癌的分化程度相关。为进一步证实miR-451在胃癌中的抑癌基因样作用及相关临床意义，本次研究通过原位杂交检测了92例胃癌组织及47例癌旁正常组织，发现miR-451在胃癌组织中的高表达率较癌旁正常胃黏膜组织明显降低，且miR-451在胃癌中的表达水平与胃癌患者的TNM分期以及淋巴结转移有关，miR-451在胃癌中表达下调与患者的不良预后亦相关。

（图1见插页）

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（2014-08-18收稿2014-10-30修回）

（本文编辑李鹏）

The expression of miR-451 and its clinical significance in gastric cancer

CHEN Tao，XIE Liming，TANG Hailin
Medical Service Center，The First Affiliated Hospital of University of South China，Hengyang 421001，China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-451 and its clinical significance in gastric cancer.Methods The miR-451 expression was detected in 92 samples of gastric cancer and 47 sapmles of normal stomach mucosa.The correlations of miR-451 expression with clinicopathologic characteristics，overall survival and disease-free survival were analyzed in patients with gastric cancer.ResultsThe overexpression rate of miR-451 was 38.04%in gastric cancer，which was significantly lower than 76.60%in adjacent normal tissues（χ2=18.503，P＜0.001）.The overexpression rate of miR-451 was significantly lower inⅢ-Ⅳstages of gastric cancer than that inⅠ-Ⅱstages（27.3%vs 54.1%，P=0.009）.The expression of miR-451 was also lower in patients with lymph node metastasis than that in patients without lymph node metastasis （27.1%vs 57.6%，P=0.004）.However，there were no significant differences in miR-451 expressions between different age，gender，histological grade and T stage groups（P＞0.05）.The overall survival rate was significantly higher in patients with high expression of miR-451 than that in patients with low expression of miR-451（69.2%vs 39.1%，P=0.003）.Conclusion miR-451 is associated with the malignant transformation，progression，and prognosis of gastric cancer，and which can be used as a potential target of therapy and a biomarker of diagnosis and prognosis of gastric cancer in the future.

stomach neoplasms；carcinoma；prognosis；gene expression；in situ hybridization；miR-451

R735.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.012

国家自然科学基金资助项目（31100935）

湖南衡阳，南华大学附属第一医院医疗服务中心（邮编421001）

陈涛（1979），男，主治医师，学士，主要从事消化、急诊医学研究