锌指蛋白185对胶质瘤细胞增殖影响的研究

陆斌，郑全辉

锌指蛋白185对胶质瘤细胞增殖影响的研究

陆斌1，郑全辉2△

目的探讨锌指蛋白ZNF185在人脑胶质瘤细胞增殖中的作用。方法标本取自2011年1月—2013年12月于唐山市工人医院就诊，经病理确诊为胶质瘤患者的肿瘤组织，以瘤旁组织作对照。提取不同组织总蛋白，Western-blot检测ZNF185的表达。提取瘤旁组织总RNA，反转录扩增ZNF185编码序列并克隆至pEGFPC2质粒，构建ZNF185表达载体。采用Lipofactamine2000将ZNF185表达载体转染人胶质瘤细胞系SF767，以转染pEGFPC2空载体细胞作为对照。采用流式细胞仪检测细胞周期变化；MTT法检测细胞增殖活性。结果与瘤旁组织相比，ZNF185在人脑胶质瘤组织中表达显著降低（P＜0.01）；转染ZNF185表达载体的胶质瘤细胞与对照细胞相比ZNF185的表达显著增加（P＜0.01）；过表达ZNF185导致SF767细胞G0～G1期细胞比例显著增加（P＜0.05），而S期细胞比例减少（P＜0.05）。同时，过表达ZNF185也导致SF767细胞的增殖速度显著降低（P＜0.05）。结论ZNF185在人脑胶质瘤细胞中发挥抑制细胞增殖的作用。

神经胶质瘤；细胞周期；细胞增殖；锌指；转染；ZNF185

神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，是临床上常见的脑恶性肿瘤之一，其发病率、复发率、病死率较高，严重危害人类身体健康。胶质瘤的发病机制复杂，是一个长期的、多因素造成的发病过程。目前对造成胶质瘤发生、发展的分子机制仍缺乏深入了解。近年来的分子遗传学研究表明，癌基因或抑癌基因的表达异常在胶质细胞瘤的发生、发展过程中发挥重要作用［1］。锌指蛋白（zinc finger protein，ZNF）185是一种c端含有LIM（Lin-1，Is1.1 and nec-3）结构域的蛋白，尽管目前已知LIM结构域蛋白在细胞分化、器官发育、细胞骨架组织以及肿瘤的发生等生物学过程中具有调控功能［2］。然而，对于ZNF185在人脑胶质瘤的发生、发展中的作用尚不明确。为此，本研究通过检测ZNF185在人脑胶质瘤和瘤旁组织的表达差异，探讨ZNF185对胶质瘤细胞细胞周期和增殖的作用，为深入了解其发病机制提供线索。

1　材料与方法

1.1材料人脑胶质瘤及瘤旁组织取自2011年1月—2013年12月于唐山市工人医院就诊，经病理确诊为胶质瘤的20例患者。人胶质瘤细胞系SF767购自北京协和细胞生物所。DMEM细胞培养液和胎牛血清（FBS）均购自GIBCO公司；TRIzol试剂盒、Lipofactamine2000购自Invitrogen公司；各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶和反转录试剂盒购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；兔抗人ZNF185一抗、兔抗人actin一抗，HRP-羊抗兔二抗购自北京博奥森公司。Western-blot底物发光检测试剂盒购自Pierce公司。pEGFPC2绿色荧光蛋白表达质粒由中科院动物所赵勇研究员提供；蛋白提取试剂盒和Bio-Rad蛋白浓度测定试剂盒购自北京天恩泽公司，引物由上海生物工程服务公司合成。氨基糖苷类抗生素G418、RNaseA、propidium iodide（PI）、四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1Western-blot检测ZNF185的蛋白表达提取人脑胶质瘤组织、瘤旁组织或胶质瘤细胞SF767总蛋白，测定蛋白浓度。各取10 μg进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后将蛋白电转（4℃、恒流300 mA、2 h）到硝酸纤维素膜（NC）上，然后将NC膜在含100 g/L脱脂奶的TBST中室温封闭2 h，加兔抗人ZNF185一抗（1∶1 000）4℃过夜，TBST洗去未结合一抗，再加HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温作用1 h，TBST洗涤3次后加ECL发光底物，室温反应1 min，暗室曝光。

1.2.2ZNF185表达载体构建和质粒提取瘤旁组织总RNA提取和反转录按照试剂盒说明书进行。PCR采用Pfx高保真DNA聚合酶和下列引物:上游5′-GGAATTCATGAGTATCTCAGCTCTTG-3′，下游5′-ACGCGTCGACTAGAAGAGCTTCTCATAGC-3′。上、下游引物分别加入EcoRⅠ/SalⅠ酶切位点。反应条件：94℃2 min，然后94℃30 s，58℃45 s，72℃延伸1 min；30个循环，最后72℃孵育10 min，PCR产物胶回收并纯化。EcoRⅠ/SalⅠ双酶切PCR产物和pEGFPC2质粒，回收纯化酶切产物，并利用T4 DNA ligase将其连接在一起。转化，挑克隆进行序列测定。根据QIAGEN质粒提取试剂盒说明书进行质粒的提取和纯化。

1.2.3细胞培养和转染人胶质瘤细胞系SF767采用DMEM培养基，10%胎牛血清常规培养。表达ZNF185和空载体质粒转染采用Lipofactamine2000，按操作说明进行。为获得稳定转染ZNF185的细胞，SF767细胞在转染24 h后，用胰酶消化，1∶2分离培养过夜，加入G418（终浓度为600 mg/L）筛选抗性克隆，每3 d更换1次加G418的培养基，选择培养1个月后，采用流式细胞仪分选绿色荧光蛋白阳性细胞，分别命名为EGFPC2-ZNF185和EGFPC2，在G418（200 mg/L）保持筛选压力的条件下常规培养，并采用Westernblot检测稳定筛选细胞中ZNF185的表达。

1.2.4细胞周期测定将稳定转染EGFPC2-ZNF185和EGFP2空载体的SF767细胞用0.25%胰蛋白酶消化，在75%乙醇中固定过夜。PBS洗细胞，加100 g/L RNaseA，37℃孵育30 min。细胞重悬于0.5 mL PBS，加入propidium iodide染色30 min，以FACS分析PI荧光及周期分布。每个样品收集2×104个细胞进行分析，重复3次。

1.2.5细胞增殖检测分别将EGFPC2-ZNF185和EGFPC2空载体转染SF767细胞，接种至96孔培养板（1×104/孔），每个时间点3个重复孔。于37℃、5%CO2条件下培养。随后分别于24、48、72、96和120 h每孔加25 μL MTT（10 g/L），于上述条件下继续培养 4 h，吸净培养液，每孔加 200 μL DMSO，放置5～10 min后，以DMSO作空白对照，用酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光度（A）值，以培养时间为横轴，平均A值为纵轴，绘制生长曲线。

1.3统计学方法应用SSPS 16.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ZNF185在人脑胶质瘤中的表达水平ZNF185在人脑胶质瘤组织中的相对表达量为0.45±0.09，低于在瘤旁组织中的相对表达量为 1.47±0.19（t= 33.547，P＜0.01），见图1。

Fig.1 ZNF185 protein expression in glioma and tumor adjacent tissues图1人脑胶质瘤和瘤旁组织中ZNF185的蛋白表达水平

2.2ZNF185基因表达载体的构建和测序挑取ZNF185基因表达载体克隆测序。结果显示，克隆cDNA包含全长ZNF185编码序列。此序列羧基端含有2个锌指结构组成的LIM结构域，氨基端为肌动蛋白骨架结合结构域（ATD），见图2。

2.3ZNF185胶质瘤细胞SF767细胞周期Western-blot检测结果表明，与转染EGFPC2空载质粒的细胞相比，转染EGFPC2-ZNF185的SF767细胞中ZNF185表达显著增加（P＜0.01），见图3a、b。流式细胞仪检测结果显示，与转染pEGFPC2空载质粒的SF767相比，转染EGFPC2-ZNF185质粒的SF767处于DNA合成期（S期）的细胞比例显著降低，而处于静止G0～G1期的细胞比例显著增加（P＜0.05），见图3c、d。

Fig.2 ZNF185 RT-PCR and sequencing of ZNF185 expression plasmid图2 ZNF185反转录PCR和表达载体的克隆测序

2.4过表达ZNF185对SF767细胞增殖影响MTT结果显示，EGFPC2-ZNF185组SF767细胞与对照EGFPC2组相比，A570值于第1天和第2天差异无统计学意义（P＞0.05），而第3天至第5天A570值均显著低于EGFPC2组（P＜0.05），见表1。

Tab.1　Comparison of the proliferation between differently tranfected SF767 cells表1　不同转染组SF767细胞增殖的比较（n=3，±s）

Tab.1　Comparison of the proliferation between differently tranfected SF767 cells表1　不同转染组SF767细胞增殖的比较（n=3，±s）

＊P＜0.05

组别EGFPC2 EHFPC2-ZNF185 t 24 h 0.13±0.01 0.12±0.01 2.031 120 h 0.78±0.02 0.45±0.05 5.436＊72 h 0.31±0.02 0.20±0.01 7.970＊96 h 0.55±0.03 0.32±0.04 8.690＊48 h 0.21±0.02 0.16±0.01 4.257

Fig.3　The effect of ZNF185 over expression on the cell cycle of SF767 cells图3　过表达ZNF185对SF767细胞周期的影响

3　讨论

3.1胶质瘤发生的分子机制人脑胶质瘤是神经系统高度恶性的肿瘤，据报道其5年生存率约为20%［3］。目前研究发现胶质瘤的发生、发展与多种癌基因过度表达以及抑癌基因失活密切相关［4］。但目前对其发生、发展的精确分子机制尚不完全清楚。

3.2ZNF185发挥抑癌基因的作用ZNF是一类含Zn离子并具有手指状结构域的蛋白质，在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用。Zhang等［5］报道ZNF185蛋白在人多种组织表达。Vanaja等［6］首先发现与正常前列腺组织相比，ZNF185在前列腺癌组织中的表达降低。且Medina等［7］发现ZNF185在肺癌的发生、发展过程中表达也显著降低。笔者近期研究结果表明，ZNF185在粒细胞白血病细胞中与正常外周血粒细胞相比表达也显著降低［8］。以上结果提示ZNF185可能在多种组织中发挥抑癌基因的作用。

3.3ZNF185在人脑胶质瘤中的表达和功能本研究发现，与瘤旁组织相比，ZNF185在人脑胶质瘤组织中表达显著降低。在人脑胶质瘤细胞系SF767中过表达ZNF185，与对照组细胞相比，过表达ZNF185细胞出现细胞周期G0～G1期阻滞，同时S期细胞减少，细胞增殖减慢。表明ZNF185在人脑胶质瘤细胞中也发挥抑癌基因的作用。

3.4ZNF185的可能表达调控机制对于ZNF185在人脑胶质瘤细胞中表达降低的原因及其发挥作用的机制目前还不清楚。通过对该基因上游调控序列的研究发现，在前列腺癌和肺癌等组织中，ZNF185基因的启动子部位呈高度甲基化状态［6，8］。另有报道表明，ZNF185的表达水平受染色质重塑蛋白BRG1 （SNF复合体成分之一）的调节，发现ZNF185随BRG1表达的降低而降低［8］。研究发现，ZNF185通过其氨基端ATD结构域与细胞肌动蛋白纤维系统的相互作用可能是其发挥抑癌作用的机制之一［9］。以上结果为进一步深入研究ZNF185在人脑胶质瘤细胞中的表达调控和作用机制提供了线索，并有待在今后研究中逐步加以解决。

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（2014-06-12收稿2014-10-16修回）

（本文编辑李鹏）

The effect of zinc finger protein 185 on the proliferation of human glioma cells

LU Bin1，ZHENG Quanhui2△
1 Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China；2 Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Disease；School of Basic Medical Science，Hebei United University
△Corrsponding AuthorE-mail：zhqhdlp@sohu.com

ObjectiveTo explore the role of zinc finger protein（ZNF）185 in the proliferation of human glioma cells. MethodsHuman glioma tissues and tumor adjacent tissues were obtained from glioma patients diagnosed pathologically in Tangshan Gongren Hospital from January 2011 to December 2013.Total protein was extracted from different tissues.The ZNF185 expression was detected by Western-blot assay.Total RNA was extracted from tumor adjacent tissues.ZNF185 coding sequence was obtained by RT-PCR and inserted into pEGFPC2 plasmid to construct the ZNF185 expression vector.Lipofactamine2000 was used to transfect the ZNF185 expression vector to human glioma cell SF767.pEGFPC2 blank vector transfected SF767 cells were used as control.Changes of cell cycle were analyzed by flow cytometry，and cell proliferation was analyzed by MTT assay.ResultsThe expression of ZNF185 decreased significantly in human glioma tissues compared to that of tumor adjacent tissues（P＜0.01）.The over expression of ZNF185 in SF767 resulted in the increased proportion of cell cycle G0-G1phase，but decreased proportion of S phase（P＜0.05）.Furthermore，the cell proliferation was significantly inhibited in the ZNF185 over-expressed SF767 cells compared with that of blank vector transfected cells（P＜0.05）.ConclusionZNF185 plays an inhibitory role in cell proliferation of human brain glioma cells.

glioma；cell cycle；cell proliferation；zinc fingers；transfection；ZNF185

R739.41

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.005

河北省自然科学基金面上项目（H2013209019）；唐山市科技局指令性项目（13130290z）

1河北省唐山市工人医院神经外科（邮编063000）；2唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北联合大学基础医学院

陆斌（1974），男，硕士，副主任医师，主要从事神经外科学方面研究

△E-mail：zhqhdlp@sohu.com