ADAM 33基因S1、S2位点单核苷酸多态性与新疆维吾尔族COPD易感性的关系

郝娥娥，关键，许西琳，高岩，张中宏，王莎莎，王珊

ADAM 33基因S1、S2位点单核苷酸多态性与新疆维吾尔族COPD易感性的关系

郝娥娥，关键△，许西琳，高岩，张中宏，王莎莎，王珊

目的探讨ADAM 33基因S1、S2位点单核苷酸多态性（SNP）与中国新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者易感性的关系。方法收集217例COPD患者（病例组）和218例健康对照者（对照组）外周血标本，提取标本DNA，采用美国生物应用系统公司（ABI）SNaPshot SNP分型技术检测ADAM 33基因S1、S2位点单核苷酸多态性。结果病例组和对照组S1位点CC、CT、TT 3种基因型分布和C、T等位基因分布频率比较差异无统计学意义；S2位点CC、CG、GG 3种基因型分布和C、G等位基因分布频率比较差异无统计学意义。病例组S1、S2位点基因型与肺功能相关临床指标的关系显示：S1、S2位点3种基因型第1秒用力呼气容积（FEV1）预计值（%）比较、FEV1/用力肺活量（FVC）比较差异无统计学意义。单体型分析结果显示3种单体型在病例组和对照组中比较差异无统计学意义。结论ADAM 33基因S1、S2位点SNPs与新疆维吾尔族人群COPD患者易感性无明显相关性。

肺疾病，慢性阻塞性；ADAM蛋白质类；多态性，单核苷酸；维吾尔族；ADAM 33基因

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以气流受限为特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关；目前COPD的发病机制仍未完全阐明，环境方面吸烟是COPD发生、发展最重要的危险因素。然而，并不是所有COPD患者都是由吸烟引起的，这表明遗传因素在COPD的发病机制中也起一定作用。研究发现解整合素-金属蛋白酶33 （ADAM33）基因是哮喘和气道高反应性（AHR）的易感基因［1］。随后研究发现该基因与肺功能下降也具有相关性；而气道高反应性与肺功能下降是COPD病程发生、发展的重要危险因素［2］。近期已有研究发现ADAM 33基因与COPD存在一定的相关性［3］。ADAM 33基因与COPD的相关性研究已成为当前热点。本研究旨在探讨ADAM 33基因S1、S2位点单核苷酸多态性（SNP）与新疆维吾尔族人群COPD易感性及肺功能下降的关系，从分子水平研究遗传因素在新疆维吾尔族人群COPD发病中的作用。

1　对象与方法

1.1研究对象病例组选自2013年1月—2014年6月新疆维吾尔自治区人民医院、石河子大学医学院第一附属医院、喀什地区第一人民医院、伊犁州新华医院、沙湾县人民医院呼吸科住院及门诊COPD患者，所有COPD诊断符合中华医学会呼吸病学分会制定的我国《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）》。COPD肺功能诊断标准：第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV1/FVC）＜70%。经过详细询问病史及体格检查，并进行胸部X线检查和肺功能测定，共纳入217例COPD患者；同期选取218例健康体检者作为对照组。2组间性别、年龄、吸烟史、吸烟指数、体质指数（BMI）比较差异均无统计学意义，FEV1预计值（%）、FEV1/ FVC（%）比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。排除支气管哮喘、支气管扩张、间质性肺疾病、心血管疾病、肺癌等病史。所有收集资料人员进行严格培训，入选对象均签署知情同意书。

Tab.1　Basic information of two groups表1　病例组和对照组的基本资料

1.2方法

1.2.1DNA提取所有入选对象采外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用TIANGEN生化科技有限公司提供的全血基因组DNA提取试剂盒（非离心柱型）提取DNA，-80℃保存备用。

1.2.2ADAM3基因S1、S2位点多态性检测 （1）引物设计。根据GenBank提供的基因序列，使用Primer 3软件设计引物，S1、S2位点在基因上位置临近共用1对引物序列，F：5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′；R：5′-GTGGTGCACCTGCTCAGGACTC-3′，扩增片段长度为365 bp。采用SNaPshot分型方法进行分型：对分型结果进行双盲样本质控和阴性对照质控；SNaPshot反应过程中SNaPshot多重单碱基延伸反应延伸引物序列：S1位点TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTGCTGGCCATGCTCCTCAGC；S2位点 TTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTGCTGCCTCTGCTCCCAGG。（2）PCR扩增反应。PCR反应体系（10 μL）包含10×HotStarTaq buffer 1 μL，25 mmol/L Mg2+0.6 μL，2.5 mmol/L dNTP1.2 μL，5 U/μL Hot-StarTaq polymerase（Qiagen Inc）0.2 μL，1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物（上下游引物各0.5 μL），5 μL超纯水。多重PCR反应采用Touch-down PCR反应程序：95℃变性2 min；94℃变性20 s，65℃退火40 s，每个循环下降0.5℃，72℃延伸1.5 min，11个循环。然后94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，24个循环。最后72℃延伸2 min。结束后4℃保存。PCR扩增后，取PCR反应产物1.5 μL做琼脂糖凝胶电泳检测，有目的片段则表明实验成功。（3）PCR产物纯化。在15 μL PCR产物中加入5 U SAP和2 U ExoⅠ酶，震荡混匀，37℃保温1 h，然后75℃保温15 min以灭活SAP和ExoⅠ酶。纯化好的模板可以在4℃保存24 h或-20℃长期保存。（4）延伸反应。延伸反应体系（10 μL）包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit （ABI），2 μL纯化后多重PCR产物，1 μL延伸引物混合物，2 μL超纯水。延伸反应程序：96℃变性1 min；然后96℃变性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸30 s，28个循环；最后60℃延伸30 s。结束后4℃保存。延伸产物纯化：在10 μL延伸产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1 h，75℃保温15 min以灭活酶，4℃可保存24 h或-20℃长期保存。（5）延伸产物测序。取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di Formamide混匀，总体积10 μL，95℃变性5 min后上 ABI3730XL测序仪。运用 GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）软件对实验结果进行分析。

1.3统计学方法运用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验。基因频率采用基因计数法计算，使用χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。运用Haploview软件分析S1、S2位点之间的连锁不平衡关系；使用Phase软件推断群体样本的单体型。组间基因型及等位基因频率、单体型分布差异比较采用χ2检验，并计算OR值和95%CI。P＜0.05为差异统计学意义。

2　结果

2.1ADAM33基因S1、S2位点PCR产物电泳结果因ADAM33基因S1、S2位点位置临近，PCR扩增产物为一段长365 bpDNA片段，见图1。

2.2ADAM33基因S1、S2位点测序结果S1位点对照组217个样本基因分型成功，1个样本基因分型失败；病例组216个样本基因分型成功，1个样本基因分型失败。S2位点对照组217个样本基因分型成功，1个样本基因分型失败；病例组215个样本基因分型成功，2个样本基因分型失败。测序结果经GeneMapper4.1软件处理后S1、S2位点的SNaP-shot图像，见图2、3。

Fig.1 The electrophoresis map of PCR product of part samples of S1，S2 locus in ADAM33 gene图1 ADAM33基因S1、S2位点部分样品PCR产物电泳图

Fig.2　S1 locus waveform and genotype of ADAM33 gene图2ADAM33基因S1位点的波形和基因型

Fig.3　S2 locus waveform and genotype of ADAM33 gene图3ADAM33基因S2位点的波形和基因型

2.3Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验S1位点病例组、对照组χ2分别为0.005、2.116，S2位点病例组、对照组χ2分别为0.118、0.013（均P＞0.05），2组研究样本的群体代表性良好。

2.42组基因型及等位基因频率分布比较病例组与对照组中S1、S2位点的基因型以及等位基因频率分布差异无统计学意义，见表2、3。

2.5病例组ADAM33基因S1、S2位点基因型与肺功能相关临床指标的关系S1、S2位点不同基因型间FEV1预计值（%）比较差异无统计学意义，S1、S2位点不同基因型间FEV1/FVC比较差异也无统计学意义，见表4。

2.6ADAM33基因S1、S2位点之间连锁不平衡及单体型分析S1、S2位点存在连锁不平衡（D′值= 1）。单体型在病例组和对照组之间比较差异无统计学意义，见表5。

Tab.2　Comparison of S1 locus genotype and allele frequency distribution between two groups表2　病例组与对照组S1位点基因型及等位基因频率分布比较　例（%）

Tab.3　Comparison of S2 locus genotype and allele frequency distribution between two groups表3　病例组与对照组S2位点基因型及等位基因频率分布比较　例（%）

Tab.4 The relationship between S1,S2 locus genotype of ADAM 33 gene and clinical indicators of lung function in patient group表4病例组ADAM33基因S1、S2位点基因型与肺功能指标的关系　（%,±s）

均P＞0.05

S1位点基因型C/C C/T+T/T t n 188 28 FEV1预计值57.40±12.55 58.75±12.11 0.532 FEV1/FVC 56.02±9.43 56.79±9.73 0.401 S2位点基因型C/C C/G G/G F n 123 78 14 FEV1预计值58.25±12.48 56.50±12.41 58.43±13.31 0.499 FEV1/FVC 56.83±8.74 55.24±9.51 54.71±14.59 0.831

3　讨论

ADAM 33是ADAM基因超家族的一员，编码ADAM 33的基因定位于20号染色体短臂（20p13），含22个外显子和21个内含子，长度超过14 kb，编码一种基质金属蛋白酶，包含813个氨基酸，其结构类似于ADAM家族的其他成员，由8个结构域组成［4］。2002年，Van Eerdewegh发现ADAM 33与哮喘相关，可作为其候选基因。近期研究发现，ADAM 33可以影响多种疾病表型；在慢性气道疾病中，对于ADAM 33基因的认识不再仅局限于支气管哮喘。人们又把ADAM 33基因作为COPD的易感基因在不同人群中进行研究［5］。目前研究表明，ADAM 33基因多态性是COPD发生、发展的重要危险因素［3］，但ADAM 33基因多态性是如何参与COPD的发病机制与病情进展，以及如何影响其发病尚未完全明了。

Tab.5　Comparison of S1,S2 locus haplotype frequency between two groups表5　病例组和对照组S1、S2位点单体型频率比较例（%）

最近关于ADAM33基因多态性与COPD的关联性研究较多，其中ADAM33基因S1、S2位点多态性在不同人群中的研究结果也不尽相同。2007年Gosman等［6］对参与GLUCOLD计划的COPD患者进行研究，分析了ADAM 33基因的8个多态性基因位点，结果发现T1、T2、S2、ST+5等4个位点与COPD的易感性相关，而Q-1、S1、F+1、V4与COPD无相关性。Tan等［7］对中国蒙古族人群ADAM 33基因的8个多态性基因位点行基因型分型，发现S1、S2、Q-1和F+1位点与COPD有一定相关性。Sadeghnejad等［8］对高加索人群中的研究发现Q-1、S1、S2、V1、V4位点与COPD易感性相关。Zhou等［9］对亚洲人群ADAM 33基因的9个多态性基因位点进行Meta分析，结果显示T1、T2、S1、Q-1、F+1、ST+5位点与COPD的发生有关联；而V4、T+1、S2位点与COPD无关联。Li等［10］对中国人群ADAM 33基因中的T1、S2位点进行Meta分析，结果发现S2位点与COPD无关联。以上研究结果的不同表明目前对于S1、S2位点与COPD的发生有无相关性仍无定论。

本研究结果并未发现ADAM33基因S1、S2位点多态性及单体型与COPD具有相关性。这可能与种族、地域的差异有关，不同人群与COPD相关的ADAM 33基因SNP位点可能不尽相同。且此次试验只对ADAM33基因上的2个位点进行了研究，对于其他位点与新疆维吾尔人群COPD患者的关系尚不清楚。也有可能因为COPD发病的调节因素众多，单个基因的研究不能反映COPD发病机制的复杂性，发病机制复杂的不同都可使基因频率分布不同，所以有必要进一步检测ADAM33基因中其他区域的多态性位点与COPD的关系，建立一个完整的与疾病风险相关的基因体系。另外本次试验检测的样本量并不能完全代表整个人群的基因突变情况，应该进一步扩大样本量降低造成ADAM33基因多态性位点假阴性结果的可能。

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（2014-09-24收稿2014-11-01修回）

（本文编辑李国琪）

Association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM33 gene and chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang Uygur population

HAO Ee，GUAN Jian△，XU Xilin，GAO Yan，ZHANG Zhonghong，WANG Shasha，WANG Shan
Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical School，Shihezi University，Shihezi 832008，China
△Corresponding AuthorE-mail:guanjian6@163.com

ObjectiveTo investigate the association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM 33 gene and chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and lung function in Xinjiang Uygur population.MethodsBlood samples from 217 COPD patients and 218 healthy controls were collected.Samples of DNA was extracted，and S1，S2 single nucleotide polymorphism（ADAM 33）was detected by ABI SNaPshot SNP genotyping.ResultsThere were no significant differences in the frequencies of S1 locus CC，CT，TT genotypes and C，T alleles between patient group and control group（P＞0.05）.There were no significant differences in the frequencies of S1 locus CC，CG，GG genotypes and C，G alleles between patient group and control group（P＞0.05）.In patient group，there were no significant differences in S1，S2 locus genotype and clinical indicators of lung function display，and in the FEV1%predicted and FEV1/FVC（P＞0.05）.Haplotype analysis showed that there were no significant differences in three kinds of haplotypes between patient group and control group（P＞0.05）.ConclusionThere is no significant difference in the polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM 33 gene and the susceptibility to COPD in Xinjiang Uygur population.

pulmonary disease，chronic obstructive；ADAM proteins；polymorphism，single nucleotide；UYGUR nationality；ADAM 33

R563

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.002

国家自然科学基金资助项目（81360009）

石河子大学医学院第一附属医院呼吸内科（邮编832008）

郝娥娥（1988-），女，硕士研究生，主要从事呼吸系统疾病研究

△E-mail:guanjian6@163.com