新型三维复合仿生网络的构建及其组织相容性评价

崔曼，张欣，马丽桃，熊艳杰，车鹏程，姚芳莲，孙红△

新型三维复合仿生网络的构建及其组织相容性评价

崔曼1，张欣1，马丽桃1，熊艳杰1，车鹏程1，姚芳莲2，孙红1△

目的构建并评价新型三维复合仿生网络的组织相容性。方法采用仿生学方法，将壳聚糖、羟基磷灰石、明胶、果胶按一定比例制成新型三维复合仿生网络，将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1与材料进行复合培养，通过倒置相差显微镜、石蜡切片常规染色、扫描电镜、F-DA荧光染色法评价细胞相容性；将制备好的生物支架材料植入SD大鼠的背部皮下，术后2、4、8、12周评价组织相容性、血管化能力及体内降解情况。结果新型三维复合仿生网络呈三维多孔状，细胞在材料上贴附生长良好，呈多角形或梭形，形态饱满；皮下包埋实验发现：早期有轻微的炎症反应，随时间延长而消退，后期有血管化发生，材料降解吸收比较缓慢。结论新型三维复合仿生网络组织相容性好，易于血管化，是一种很好的骨组织工程支架材料。

新生血管化，生理性；组织相容性；组织工程；壳聚糖；三维复合仿生网络

由创伤、肿瘤、炎症等造成的大范围骨缺损如果没有骨移植材料很难被修复，因此寻找理想的骨移植材料仍是外科的难题之一。目前，已经有很多种天然材料和合成材料用于修复骨缺损以促进骨再生［1］。三维支架可以创造一种微环境，支撑细胞黏附生长、增殖和发挥功能。此外，骨组织工程支架材料还应具有一定的力学强度和接近正常人骨的孔隙率和孔径［2］。为此，本研究以壳聚糖、明胶、果胶为基材，通过接枝偶联反应，引入活性基团，经纳米羟基磷灰石的原位生成反应，构建了新型三维复合仿生网络，并利用细胞与材料复合培养法和皮下植入试验评价该材料的组织相容性，为临床骨缺损修复选择合适的骨移植材料提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料SD大鼠，体质量200～250 g，雌雄不限，河北联合大学动物实验中心提供，MC3T3-E1细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供），胎牛血清（天津血液研究所），α-MEM培养基（Gibco公司，美国），二甲基亚砜（DMSO，天津灏洋生物工程公司），扫描电镜（XL30 PHILIPS，荷兰），倒置相差显微镜（Nikon，日本），荧光显微镜（Olympus，日本）。常规培养基组分：α-MEM培养基+10%胎牛血清。

1.2方法

1.2.1新型三维复合仿生网络的制备由天津大学化工学院高分子科学与工程系提供，采用仿生学方法，在壳聚糖加明胶的基础上，将羟基磷灰石和果胶的复合物分散到壳聚糖明胶溶液中，以戊二醛交联形成新型三维复合仿生网络。材料按实验的要求制备成直径1 cm，厚0.5 cm，60Co照射消毒备用。

1.2.2新型三维复合仿生网络与MC3T3-E1细胞的复合培养将MC3T3-E1细胞接种于25 cm2的培养瓶内并加入5 mL常规培养基，置37℃、5%CO2培养箱中静置培养，每隔48 h换新鲜培养基，倒置相差显微镜观察细胞相互融合达80%～90%时用0.25%胰酶消化，新型三维复合仿生网络置于24孔培养板内，将MC3T3-E1细胞悬液以2×105/mL密度接种，每孔加1 mL常规培养基，置37℃、5%CO2培养箱中静置培养。

1.2.3观察指标24 h、72 h时倒置相差显微镜观察新型三维复合仿生网络边缘的细胞形态、生长状况及培养基有无混浊。于接种后1 d、7 d、14 d取材，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，二甲苯透明，中性树胶固封，光学显微镜下观察细胞的生长状况。于接种后1 d、7 d、14 d取材，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，表面喷金后，在扫描电镜下观察细胞的黏附、生长及形态学特征。利用荧光素二醋酸盐（F-DA）原位检测材料内的细胞生长形态。

1.2.4皮下植入实验取SD大鼠12只，材料植入前60Co照射消毒。术前3 d用8%硫化钠对手术部位脱毛，手术当天用10%的水合氯醛以0.3 mL/100 g的剂量经腹腔注射麻醉。固定后用75%乙醇消毒手术部位3次，然后铺无菌孔巾，在脊柱正中切开皮肤，切口长约3 cm，提起腰背筋膜剪开，钝性分离，将材料左右各埋入1枚，缝合皮肤。术后3 d每天给予青霉素5万U，单笼饲养。术后2、4、8、12周分别处死3只大鼠，取出实验材料，剖开组织和材料界面，观察组织包绕情况及炎症反应程度。4%多聚甲醛固定标本，常规石蜡包埋切片，行HE染色，光镜观察。

2　结果

2.1新型三维复合仿生网络的大体形态及扫描电镜下结果大体外观呈多孔海绵状。扫描电镜下可见三维多孔的网状结构，材料平均孔隙率为90%，空隙之间的连通较好，空隙形态、取向规则有序，测量孔径大小为100～200 μm，见图1。

Fig.1　SEM observation on the novel 3-D composite bionic network（×100）图1　新型三维复合仿生网络扫描（×100）

2.2倒置相差显微镜观察MC3T3-E1细胞接种于培养瓶后细胞呈圆球形，悬浮状态，2～3 h细胞开始贴壁，24 h细胞呈长梭形或纺锤形，大部分细胞伸出突起，与邻近细胞的突起相连，48 h细胞逐渐接触相连成片状，3～5 d细胞长成致密的单层，界限不清。MC3T3-E1细胞与材料复合培养，可观察到周边细胞贴附生长好，培养基无混浊。

2.3HE染色观察细胞分别于接种后1、7、14 d，HE染色显示细胞形态清晰，呈梭形、纺锤状或多角形，细胞核大，呈圆形或椭圆形，核仁清楚可见。细胞接种后14 d，细胞数量增多，贴附生长良好，呈多角形或梭形，细胞质丰富，可见粉染的细胞外基质，见图2。

Fig.2　Histology observation on the 14-day-co-culturing tissue（HE，×200）图2　复合培养14 d组织学观察（HE×200）

2.4扫描电镜观察接种细胞后第1天，可见少量MC3T3-E1细胞呈球形，较为分散；其后细胞增多，呈梭形、星形；细胞进一步增殖，形态饱满并相互融合，伸出伪足状细长突起，伸入材料间，形成一种锚状结构，牢固黏附于材料表面，并具有良好的伸展状态。随着培养时间的延长，细胞密度逐渐增加，至14 d通过材料网状孔隙观察，在材料附着的细胞分裂增殖，分泌大量的细胞外基质包裹材料，见图3。

Fig.3　SEM observation on the 14-day-co-culturing tissue（×500）图3　复合培养14 d扫描电镜观察（×500）

2.5荧光染色细胞分别于接种后1、7、14 d进行荧光染色观察。F-DA荧光染色显示细胞生长良好，形态清晰，呈长梭形或多角形，部分区域的细胞聚集生长，有形成结节的趋势；接种后第14天细胞还可在孔内呈多层生长，见图4。

Fig.4　Fluorescence staining observation on the 14-day-co-culturing tissue（×100）图4　复合培养14 d F-DA染色荧光电镜观察（×100）

2.6组织相容性观察大体标本观察：手术后5 d，所有大鼠切口愈合良好，无感染现象。分别在术后2、4、8、12周以过量麻醉药分次注射，使动物深度麻醉，在背部原切口部位切开皮肤，发现多数材料无移位，在材料周围1 cm处整块切下组织，在包埋部位未发现感染、积液及材料碎裂，且材料降解缓慢，至12周仍可见材料。术后2周，材料完整，表面可见细小出血点，易于剥离；术后4周，材料表面可见明显毛细血管；术后8周，材料与组织粘连紧密，不易剥离，毛细血管较前更多；术后12周，材料与周围组织界限不清。

HE染色观察：2周时无组织坏死现象，可见少量散在的中性粒细胞（无明显聚集）、淋巴细胞、浆细胞等炎症细胞，未见明显的吞噬细胞、多核巨细胞，见图5A；4周时炎性细胞减少，新生的血管和成纤维细胞长入，见图5B；8周时微孔状间隙部分充满成纤维细胞、大量的功能性毛细血管，并可见多核巨细胞及淋巴细胞，见图5C；12周时材料的微孔状结构未消失，但间隙出现纤细的胶原纤维，排列较规律，血管较前减少，见图5D。

3　讨论

3.1骨组织工程的基本要素支架、种子细胞与生长因子是骨组织工程学的重要研究内容，寻找理想的细胞外支架材料更是现阶段的研究热点。理想的支架材料必须具备良好的生物相容性和可降解性、一定的机械强度、三维多孔结构和骨传导性［3-4］。

3.2壳聚糖、明胶、果胶等应用于骨组织工程材料的构建壳聚糖是多糖中仅有的一种碱性氨基多糖，其结构和某些性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极相似，利于细胞的黏附、生长、增殖，具有明显碱性、良好的生物相容性和生物降解性［5］，可将其改造成需要的形状和强度，如凝胶液、凝胶膜、多孔三维支架材料应用于组织工程中［6］。胶原是细胞外基质（ECM）的主要结构蛋白，明胶是其部分变性衍生物，具有良好的生物相容性。其中含有天冬氨酸-甘氨酸细胞结合结构域，利于细胞粘连。壳聚糖-明胶复合物可以模拟ECM作为皮肤和软骨的替代材料。果胶富含半乳糖醛酸及甲酯化的半乳糖醛酸单位，可结合蛋白质和其他多糖，存在于植物细胞壁中，有刚性且化学性质稳定［7］。果胶是一种聚阴离子多糖，可以携带信号分子并传输许多生物活性物质，可以作为一种新的生物医用材料［8］。

3.3纳米羟基磷灰石在骨组织工程中的作用天然骨是具有复杂结构的生物复合材料，1/3为有机成分，其中胶原占90%，非胶原成分占10%，2/3为无机成分，主要是磷酸钙盐类，基本单位为纳米级羟基磷灰石［9］。因此提高材料的机械性能十分重要，为了更好地模拟天然组织中细胞外基质的结构和功能，在壳聚糖-明胶-果胶网络复合膜的基础上加入纳米羟基磷灰石制成新型三维复合仿生网络。纳米羟基磷灰石是一种性能优良的无机陶瓷材料，同时具有独殊的特性，例如良好的生物相容性和生物活性，以及柔韧的组织结构，是一种可应用于临床的很有潜能的组织工程材料［10］。复合支架中纳米羟基磷灰石的加入能提高支架的生物相容性［11］，在增强细胞增殖的同时，还促进了材料的骨传导性和骨诱导性［12］。

3.4组织相容性评价在评价材料的相容性过程中，最直接的方法是体外细胞复合培养法和体内直接接触法。细胞培养法是检测材料生物相容性的重要手段之一，具有敏感性高和实验周期短等优点［13］。本实验采用MC3T3-E1细胞，细胞行为与成骨细胞相似；材料具有大小合适的孔径、较高的孔隙率和类似自然骨的连通微孔结构，利于MC3T3-E1细胞的黏附生长、营养物质的渗入和废物的排出，并促进细胞在材料上的迁移、分化和增殖。通过将MC3T3-E1细胞与材料复合培养，直接观察细胞的贴附生长、分化和增殖情况，细胞在材料上生长良好，分布均匀，结合牢固，无排斥反应发生，说明新型三维复合仿生网络的所有组分具有适合细胞生长的微环境，该材料适合种子细胞的停泊、生长、黏附、增殖，可用做组织工程支架。“体内植入试验”将材料植入大鼠背部皮下，可从宏观和微观水平评价材料对组织的局部反应，包括早期的炎症反应和后期血管化及纤维增生情况。然而，在骨组织再生的一个主要的挑战是血管化，如果血液供应（营养和氧气）不能快速建立，该中心的工程化骨将很快出现坏死。由于氧在活组织的毛细血管扩散是有限的，约150 μm［平均毛细血管间距为（304±30）μm］，因此，在较大体积的组织工程构建中，血管化情况至关重要［14］。本研究显示该材料引起体内的炎症反应轻微且持续时间很短，4周左右即明显缓解，在4～8周可见大量新生血管的形成，在12周左右稳定，表现出良好的组织相容性。组织学观察可以获得早期、充分的血管化，降解吸收缓慢。因此新型三维复合仿生网络在短期观察中具有良好的组织相容性，但该材料植入骨缺损部分是否具有成骨诱导活性和增加骨愈合，是否可以用于骨重建和骨缺损的替代材料，需要进一步研究。

（图5见插页）

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（2014-09-09收稿2014-10-20修回）

（本文编辑李鹏）

Construction of novel 3-D composite bionic network and evaluation of its histocompatibility

CUI Man1，ZHANG Xin1，MA Litao1，XiongYanjie1，CHE Pengcheng1，YAO Fanglian2，SUN Hong1△
1 Department of Pathology，Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2 School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University
△Corresponding authorE-mail：xsun1@hotmail.com

ObjectiveTo construct novel 3-D composite bionic network and evaluate the histocompatibility.MethodsThe novel 3-D composite bionic network was prepared from chitosan，hydroxyapatite，gelatin and pectin in certain ratio by biomimtic approach，which was co-cultured with MC3T3-E1.The cell compatibility was studied by using inverted phase contrast microscope，routine paraffin section staining，scanning electron microscopy and F-DA staining.The resultant scaffold material was implanted into the dorsal subcutaneous space of SD rats.The histocompatibility，blood vessel capabilities and the degradation of the material were observed 2，4，8 and 12 weeks after surgery.ResultsThe structure of novel 3-D composite bionic network was three-dimensional and porous.The cells attached on scaffolds attached and grew well with polygonal or fusiform form.It was found that inflammatory reactions were alleviated gradually in the early stage.There was an increasing angiogenesis at late stage.Materials degraded and absorbed more slowly.ConclusionThe present study suggests that the novel 3-D composite bionic network has good histocompatibility with easy vascularization，and will be a candidate scaffold for bone tissue engineering.

neovascularization，physiologic；histocompatibility；tissue engineering；chitosan；3-D composite bionic network

R318.08

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.003

国家自然科学基金资助项目（81101448）；河北省自然科学基金资助项目（C2011401006，H2012401017）；河北省引进留学人员资助项目（C201400560）

1河北联合大学基础医学院病理教研室（邮编063000）；2天津大学化工学院

崔曼（1987），女，硕士在读，主要从事组织工程方面研究

△E-mail：xsun1@hotmail.com