川崎病急性期患儿血清活化HUVECs NF-κB并促进MMP- 9分泌

刘丽莎，朱纯亮，韩 勍，殷丝雨，谈 诚，韩晶晶，陈红兵

(南京医科大学 附属南京儿童医院 检验科， 江苏 南京 210008)



川崎病急性期患儿血清活化HUVECs NF-κB并促进MMP- 9分泌

刘丽莎，朱纯亮，韩 勍，殷丝雨，谈 诚，韩晶晶，陈红兵*

(南京医科大学 附属南京儿童医院 检验科， 江苏 南京 210008)

川崎病(Kawasaki disease，KD)，又称皮肤黏膜淋巴结综合征(mucocutaneous lymph node syndrome, MCLS)，是一种好发于5岁以下儿童和婴幼儿的急性全身性血管炎性疾病。 病变可累及动脉、静脉和毛细血管，尤以冠状动脉为明显，成为小儿后天性心脏病的主要病因[1]。目前，KD病因与发病机制尚不十分清楚, 本实验观察川崎病患儿急性期血清对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)NF-κB P65表达及MMP- 9分泌的影响，及NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂(PDTC)对上述过程的影响。

1 材料与方法

1.1 材料：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系；RPMI1640培养基和胰蛋白酶；胎牛血清；MMP- 9试剂盒。

1.2 血清制备：40例在本院明确诊断为典型川崎病急性期(发热10 d 内，IVIG使用前)患儿(年龄2～5岁)、23例急性上呼吸道感染的患儿及20例同年龄段健康儿童，各组年龄无差异，采集各组儿童静脉血3 mL，分离血清，-80 ℃ 冻存。标本的收集均获得患儿家属知情同意和医学伦理委员会的同意。

1.3 细胞培养：1)正常血清组(control)1.0×106个HUVECs细胞于含10%正常血清的RPMI1640 完全培养液培养24 h，弃上清液，加入无血清培养液；2)发热血清组(F)：用含10%急性发热患儿血清培养液，余同control组；3)急性期血清组(KD)：用含10%急性期血清培养液，余同control组；4)PDTC+急性期血清组(PDTC)：用含10%急性期血清培养液培养24 h，弃上清液，加入含PDTC(20 μmol/L)的无血清培养液。

1.5 MMP- 9活性测定：ELISA 法检测细胞上清液中MMP- 9水平，操作严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 NF-κB P65蛋白表达水平：与对照组相比，KD组NF-κB P65蛋白表达水平明显增高，PDTC可抑制NF-κB P65蛋白表达(图1)。

图1 各组HUVECs NF-κB P65蛋白表达Fig 1 The NF-κB P65 protein expression in HUVECs of various groups

2.2 MMP- 9蛋白水平：KD组血清可使MMP- 9蛋白表达水平升高(P<0.01)；PDTC可降低其表达(P<0.01)，与NF-κB P65蛋白表达水平相一致。

表1 各组NF-κB P65和MMP- 9 蛋白表达水平

groupnNF⁃κBP65MMP⁃9(ng/L)control20 015±004 30±13F23 023±005 120±20KD40 076±006∗657±87∗PDTC+KD40 027±007#234±56#

*P<0.01 compared with control and F groups;#P<0.01comparedwithKDgroups.

3 讨论

NF-κB是由Rel家族蛋白构成的二聚体蛋白质，能与多种基因的启动子和增强子特异性结合，在机体的免疫应答、炎性反应及细胞生长调控等方面发挥重要作用，促炎性细胞因子、T细胞和B细胞激活抗原、紫外线照射、电离辐射、病毒感染和各种集落刺激因子等均能激活NF-κB信号通路[2]。

基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs) 是一组参与细胞外基质降解过程的钙、锌离子依赖性内源蛋白水解酶家族。MMP- 9主要由上皮细胞、炎性细胞、单核-巨噬细胞等产生，是一种促炎蛋白酶，其启动子区含有AP-1 和NF-κB位点，可对多种促炎刺激发生反应[3]。

本研究发现用KD急性期患儿血清处理HUVECs，可上调NF-κBP65的表达，并使其分泌MMP- 9增加，用NF-κB抑制剂PDTC可降低二者表达，表明NF-κB可能作为始发炎性反应的上游环节在川崎病血管免疫炎性损伤中起重要作用，这为进一步揭示KD急性期病理损伤机制以及KD的治疗靶点奠定了理论基础。此外，MMP- 9启动子区域含有NF-κB结合位点，二者在KD急性期特别是合并冠脉损伤时具体的作用机制将在后续研究中探讨。

[1]KowalczykM,Turska-Kmie?A,ZiókowskaL,etal.Symptoms,diagnosis and characteristic abnormalities in the coronary arteries in Kawasaki disease in children[J]. Med Wieku Rozwoj, 2010,14: 344- 349.

[2] DiDonato JA, Mercurio F, Karin M. NF-κB and the link between inflammation and cancer[J]. Immunol Rev,2012,246:379- 400.

[3] Sakata K, Hamaoka K, Ozawa S,etal. Matrix metalloproteinase- 9 in vascular lesions and endothelial regulation in Kawasaki disease[J]. Circ J, 2010, 74: 1670- 1675.

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2014- 03- 07

2014- 05- 27

南京市医学科技发展基金(YKK13131)

1001-6325(2015)01-0099-02

R392.7；R34

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*通信作者(corresponding author)：etyy001@sina.com