CD147在子宫内膜异位症中的表达

金爱红　周霞平　周凤珍

[摘要] 目的 研究CD147在子宫内膜异位细胞中的表达情况，并探讨其对子宫内膜细胞的迁移和凋亡的调节作用。 方法 选取2013年6～12月于本院进行诊治的60例子宫内膜异位症患者为实验组，并以同期的60名不孕症患者为对照组，然后取实验组的异位内膜及对照组的正常子宫内膜进行检验，以实时荧光定量PCR法进行CD147的检测，统计并比较实验组进行抗体阻断前后的HES细胞迁移率及基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达。 结果 实验组CD147表达为（7.65±1.25），其明显高于对照组（0.95±0.14），差异有统计学意义（P<0.01）；经抗体阻断后的HES细胞迁移率明显低于阻断前，差异有统计学意义（P<0.01），阻断前后MMP-2表达则无明显差异（P>0.05）。 结论 CD147在子宫内膜异位细胞中呈现高表达状态，其通过MMP-2非依赖性途径来影响人子宫内膜上皮细胞HES的迁移，以达到参与疾病发生、发展的作用。

[关键词] CD147；基质金属蛋白酶2；HES细胞迁移率；子宫内膜异位症

[中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（c）-0006-05

[Abstract] Objective To study the expression situation of CD147 in endometriosis，and investigate the regulating action of CD147 for the migration and apoptosis. Methods 60 patients with endometriosis in our hospital from June to December in 2013 were chosen as the experimental group，60 patients with infertility at the same time were chosen as the control group，then the ectopic endometrium of experimental group and normal endometrium of control group were detected，CD147 were detected with PCR real-time fluorescent quantitative method，and the HES cell migration rate and MMP-2 expression of experimental group were respectively analyzed and compared before and after the blocking antibodies. Results CD147 expression of experimental group was （7.65±1.25），and it was obviously higher than that of control group （0.95±0.14），with significant difference （P<0.01），and the HES cell migration rate of experimental group after the blocking antibodies was obviously lower than that before the blocking antibodies with significant difference （P<0.01），while the MMP-2 expression before and after the blocking antibodies had no obvious difference （P>0.05）. Conclusion CD147 in endometriosis shows high expression state，and it can influence the migration of human endometrial epithelial cell HES through the MMP-2 independent pathways，in order to participate in disease progression.

[Key words] CD147；MMP-2；HES cell migration rate；Endometriosis

子宫内膜异位症是一种极为常见的妇科疾病，其在育龄妇女中的发生高达10%左右[1-3]，且其在近年来呈现升高的趋势，对于本病发生发展过程中影响指标的研究也并不少见，其中子宫内膜异位症细胞的迁移以及恶性侵袭行为是较受认可的一类说法。CD147是具有增强肿瘤细胞的侵袭能力的一类指标[4-7]，且其在子宫成纤维细胞中具有诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达增加的作用[8-9]，但是对于其在子宫内膜异位症中的变化研究却极为不足，本文中笔者就CD147在子宫内膜异位细胞中的表达情况进行研究，并探讨CD147对子宫内膜细胞的迁移和凋亡的调节作用。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年6～12月于本院进行诊治的60例子宫内膜异位症患者为实验组，并以同期的60名不孕症患者为对照组。对照组60名不孕妇女中，年龄22～42岁，平均（32.2±5.7）岁。观察组60例子宫内膜异位症患者中，年龄21～41岁，平均（32.5±5.6）岁；r-AFS分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。两组年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者均有规律的月经周期，且其子宫内膜组织均处于月经周期中的增殖阶段。研究对象术前3个月未用过任何激素治疗或消炎剂治疗。

1.2方法

取实验组的异位内膜及对照组的正常子宫内膜进行检验，以实时荧光定量PCR法进行CD147的检测，统计并比较实验组进行抗体阻断前后的HES细胞迁移率及MMP-2表达。

1.2.1 RNA提取和实时PCR分析 CD147的TaqMan5引物购自Applied Biosystems公司。总RNA样品由Trizol试剂（Invitrogen公司，美国加利福尼亚州）萃取。首先，取组织50～100 mg，剪碎，加入0.5 ml Trizol试剂匀浆，移入1.5 ml离心管中，再用0.2 ml Trizol冲洗匀浆器，剧烈震荡15 s，4℃离心（14 000 r/min），10 min后，将上层水相转移至1个1.5 mL的焦碳酸二乙酯处理的微量离心管中。为沉淀RNA，每1毫升Trizol试剂中加入0.5 ml异丙醇，加入到上层水相样品，并在-20℃下作用10～30 min。将RNA在14 000 r/min离心10 min，取其沉淀，在4℃并用1 ml 75%的乙醇洗涤1次。将适量RNA溶解在无RNase水。将RNA浓度通过S2000紫外-可见分光光度计（Perkin-Elmer公司，美国）测定，采用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad公司，美国），1 μg总RNA被转录为cDNA。进行定量PCR时，1式3份，分别在Applied Biosystems 7500Fast实时PCR系统中进行。

1.2.2免疫印迹 HES细胞在裂解缓冲液（RAPI的缓冲液：50 mmol/L pH为8.0的Tris-盐酸，150 mmol/L的NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）中提取。免疫印迹法分析参考文献[10]所述进行。不同阶段的总裂解物（每泳道40 μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到硝酸纤维素滤膜上（Schleicher & Schuel，Dasse，德国）。在TBST（50 mmol/L的Tris-盐酸，150 mmol/L的NaCl，0.05%吐温20，5%脱脂牛奶，pH 7.6）封闭孵育。加入一抗，在TBST+1.5%无脂牛奶中孵育1 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h。将膜用TBST洗涤3次，然后通过增强的化学发光法（Amersham公司，皮斯卡塔韦，新泽西州）进行检测。

1.2.3 迁移实验 该操作参考文献[11]所述进行。将5×106细胞培养在6孔板中，直至单层细胞后，此时DMEM+10%FBS培养基被替换为用DMEM+1%FBS。加入10 μg/ml的正常小鼠抗-CD147单克隆抗体作为实验组，加入10 μg/ml的小鼠IgG（Santa Cruz公司，CA，USA）作为阴性对照组。在24 h内，每间隔一段时间就计算迁移率，本研究采用至少5种成像技术计算量化每板的迁移率。

1.2.4 蛋白酶激活明胶酶谱 用抗-CD147抗体治疗24 h，进行明胶酶谱分析MMP-2的表达和活性。样品加入到含有7.5%SDS-聚丙烯酰胺和0.5%明胶的凝胶中进行电泳。凝胶结束后，加入2.5%的Triton X-100，在室温下温育30 min，弃除Triton X -100，将胶放入含有50 mmol/L的Tris-HCl（pH为7.5，200 mmol/L的NaCl，5 mmol/L的CaCl2和0.02%Brij35），37℃孵育过夜，然后用0.5%考马斯亮蓝G染色30 min，再用脱色液（50%%甲醇和10%乙酸）室温作用30 min。明胶酶活性被可视化为蓝色背景上的白色条带，本实验重复2次。

1.2.5 HES细胞的生存/凋亡测定 参考以往研究，CD147可以调节精母细胞的生存/凋亡[12]。因此，在本实验中，笔者采用MTS实验研究CD147对细胞生长的影响。加入10 μg/ml的抗CD147抗体后，观察子宫内膜细胞的活性情况及其与时间的相关性。CD147阻断后，HES细胞的活力下降，可能原因是抑制细胞增殖或增强细胞凋亡。为了区分这两种可能性，笔者在HES细胞中加入10 μg/ml的抗CD147抗体，采用免疫印迹法测定Bax、caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）。

1.3统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 两组研究对象内膜细胞CD147表达的比较

实验组异位内膜内CD147表达为（7.65±1.25），明显高于对照组（0.95±0.14），差异有统计学意义（P<0.01）（图1）。

2.2 实验组抗体阻断前后HES细胞迁移率及MMP-2表达的比较

通过试验研究比较显示，实验组经抗体阻断后的HES细胞迁移率明显低于阻断前，差异有统计学意义（P<0.01），使用特异抗人CD147加入体外子宫内膜上皮细胞抗体阻断CD147功能，进行细胞迁移试验，培养24 h后，加入CD147抗体后，细胞迁移距离为（150.9±10.0）μm，加入IgG抗体的细胞迁移距离为（266.8±11.5）μm，差异有统计学意义（P<0.01）（图2），而阻断前后MMP-2表达差异则无统计学意义（P>0.05）（图3），提示CD147功能的干扰并没有改变HES细胞的MMP-2的活性。

2.3体外抑制CD147功能对HES细胞凋亡的影响

当加入10 μg/ml的抗CD147抗体后，子宫内膜细胞活性被明显抑制，并且呈现时间相关性，这表明，CD147是参与调节HES细胞的生存/凋亡（图4A）。在HES细胞加10 μg/ml的抗CD147抗体后，Bax蛋白表达、caspase-3和PARP均显著上调，而总caspase-3的表达没有显著变化。这些结果表明，CD147阻断后，HES细胞凋亡增强（图4B）。

3讨论

虽然已有研究表明CD147在子宫内膜异位症中的表达增加[13-14]，但目前尚无CD147在子宫内膜细胞中的定量研究，且CD147在子宫内膜上皮细胞中的功能尚不清楚。在本研究中，笔者发现CD147在60名女性卵巢子宫内膜异位病灶组织中表达明显增高，这是第1个相对较大样本量的定量研究。此外，本研究表明，在体外子宫内膜细胞中加入CD147抗体可抑制细胞迁移并加强细胞凋亡，提示CD147其在子宫内膜异位症的发生发展中起了重要作用。

研究表明，CD147的过表达可以增强肿瘤细胞的侵袭能力，在癌症的发展过程中起重要作用[15-16]。最近，还报道了精子发生中CD147可调节生殖细胞的迁移和凋亡[17]。在女性生殖道，CD147表达在卵巢[5]、胎盘和胎膜[7]、子宫[6]。还有一些研究已经表明，CD147表达在人子宫内膜间质和腺上皮，如Braundmeier等[8]报道CD147表达定位于成纤维细胞和子宫内膜上皮细胞。值得注意的是，在人子宫内膜中，CD147的表达随着月经周期的不同而表达于不同的细胞中。在月经周期的增殖期，CD147表达明显增加，提示CD147可能参与了子宫内膜细胞增殖的调控。在本实验中笔者已经证明，加入CD147抗体后，子宫内膜细胞的存活率显著下降，细胞凋亡显著增加。细胞凋亡是用于保持组织的自我平衡状态的关键的细胞机制。越来越多的研究表明，通过细胞凋亡，可在月经周期中消除衰老的细胞，以维持子宫内膜的动态平衡。早在1998年，有学者发现在子宫内膜异位症患者中，子宫内膜细胞的凋亡减少，表明增强在位内膜细胞的存活可能增加子宫内膜异位症发病的可能性[18]。近期有研究表明，子宫内膜异位症患者中，子宫内膜表现出较高水平的增殖活性和较低水平的凋亡相关蛋白[19]。然而，如何导致子宫内膜细胞存活增强的机制尚不清楚。本研究显示，CD147在卵巢子宫内膜异位组织表达明显增加，并且在子宫内膜上皮细胞中使细胞存活增加，提示CD147可能促进子宫内膜异位症的发生发展。

一些研究已经表明，MMP-2是在子宫内膜细胞重塑过程中发挥诱导和激活的作用。最近的一项研究表明，CD147的可溶性形式由子宫内膜上皮细胞分泌，刺激子宫间质成纤维细胞分泌MMP-2[20]。此外，有学者已经证明，CD147在体外培养的牛上皮内膜细胞中，可促进MMP-2和MMP-14的表达[21]。根据基质金属蛋白酶在细胞迁移中的作用，笔者推测CD147与细胞迁移相关，这是子宫内膜异位症发病的关键。在本研究中，笔者已经证明，加入CD147抗体后，子宫内膜细胞迁移显著减少。不过MMP-2的表达和活性没有明显变化，提示CD147在子宫内膜细胞迁移中的作用是通过其他机制介导的。子宫内膜上皮细胞分泌CD147，一方面促进子宫内膜间质细胞分泌基质金属蛋白酶；另一方面，加速细胞存活及迁移，同时通过目前尚不清楚的机制在上皮细胞和基质细胞之间相互作用，从而在子宫内膜异位症的进展中起了关键作用。

总之，在卵巢子宫内膜异位症的发展过程中，CD147参与了细胞凋亡的调控，在卵巢子宫内膜异位症细胞凋亡和迁移过程中起了重要作用。进一步研究CD147在子宫内膜异位症患者子宫内膜的表达，可能会更好地阐明其分子发病机制，并有助于评估子宫内膜异位症的治疗效果。

[参考文献]

[1] Kennedy S，Bergqvist A，Chapron C，et al.ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis[J].Hum Reprod，2005，20（5）：2698-2704.

[2] Bougatef F，Menashi S，Khayati F，et al.EMMPRIN promotes melanoma cells malignant properties through a HIF-2 alpha mediated up-regulation of VEGF-receptor-2[J].PLoS One，2010，5（8）：e12265.

[3] Xiong L，Edwards CK，Zhou L.The biological function and clinical utilization of CD147 in human diseases： a review of the current scientific literature[J].Int J Mol Sci，2014，15（10）：17411-17441.

[4] Chu D，Zhu S，Li J.CD147 expression in human gastric cancer is associated with tumor recurrence and prognosis[J].PLoS One，2014，9（6）：e101027.

[5] Smedts AM，Curry TE.Expression of basigin，an inducer of matrix metalloproteinases，in the rat ovary[J].Biol Reprod，2005，73（1）：80-87.

[6] Noguchi Y，Sato T，Hirata M，et al.Identification and cha-racterization of extracellular matrix metalloproteinase inducer in human endometrium during the menstrual cycle in vivo and in vitro[J].J Clin Endocrinol Metab，2003，88（2）：6063-6072.

[7] Singh M，Kindelberger D，Nagymanyoki Z，et al.Vascular endothelial growth factors and their receptors and regulators in gestational trophoblastic diseases and normal placenta[J].J Reprod Med，2012，57（5-6）：197-203.

[8] Braundmeier AG，Fazleabas AT，Lessey BA，et al.Extracellular matrix metalloproteinase inducer regulates metalloprotein-ases in human uterine endometrium[J].J Clin Endocrinol Metab，2006，91（6）：2358-2365.

[9] Braundmeier AG，Nowak RA.Cytokines regulate matrix metalloproteinases in human uterine endometrial fibroblast cells through a mechanism that does not involve increases in extracellular matrix metalloproteinase inducer[J].Am J Reprod Immunol，2006，56（3）：201-214.

[10] Chen MH，Chen H，Zhou Z，et al.Involvement of CFTR in oviductal HCO3- secretion and its effect on soluble adenylate cyclase-dependent early embryo development[J].Hum Reprod，2010，25（7）：1744-1754.

[11] Jiang WG，Hiscox SE，Parr C，et al.Antagonistic effect of NK4，a novel hepatocyte growth factor variant，on in vitro angiogenesis of human vascular endothelial cells[J].Clin Cancer Res，1999，5（2）：3695-3703.

[12] Chen H，Fok KL，Jiang X，et al.CD147 regulates apoptosis in mouse spermatocytes but not spermatogonia[J].Hum Reprod，2012，27（6）：1568-1576.

[13] Chen H，Fok KL，Yu S，et al.CD147 is required for matrix metalloproteinases-2 production and germ cell migration during spermatogenesis[J].Mol Hum Reprod，2011，17（7）：405-414.

[14] Smedts AM，Lele SM，Modesitt SC，et al.Expression of an extracellular matrix metalloproteinase inducer （basigin） in the human ovary and ovarian endometriosis[J].Fertil Steril，2006，86（1）：535-542.

[15] Hadler-Olsen E，Winberg JO，Uhlin-Hansen L.Matrix metalloproteinases in cancer： their value as diagnostic and prognostic markers and therapeutic targets[J].Tumour Biol，2013，34（4）：2041-2051.

[16] Brezillon S，Pietraszek K，Maquart FX，et al.Lumican effects in the control of tumour progression and their links with metalloproteinases and integrins[J].FEBS J，2013，280（10）：2369-2381.

[17] Chen H，Lam FK，Jiang X，et al.New insights into germ cell migration and survival/apoptosis in spermatogenesis： Lessons from CD147[J].Spermatogenesis，2012，2（4）：264-272.

[18] Havelka P，Oborna I，Brezinova J，et al.Apoptosis and expression of Bcl-2 in human endometrium in natural and artificial cycles[J].Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med，2005，149（2）：303-307.

[19] Kim JH，Yang YI，Lee KT，et al.Costunolide induces apoptosis in human endometriotic cells through inhibition of the prosurvival Akt and nuclear factor kappa B signaling pathway[J].Biol Pharm Bull，2011，34（5）：580-585.

[20] Park JS，Lee JH，Kim M，et al.Endometrium from women with endometriosis shows increased proliferation activity[J].Fertil Steril，2009，92（4）：1246-1249.

[21] Korkmaz D，Bastu E，Dural O，et al.Apoptosis through regulation of Bcl-2，Bax and Mcl-1 expressions in endo-metriotic cyst lesions and the endometrium of women with moderate to severe endometriosis[J].J Obstet Gynaecol Res，2013，33（4）：725-728.

（收稿日期：2015-02-05 本文编辑：卫 轲）