间充质干细胞成骨分化过程中长链非编码RNA调控作用研究进展

赵培庆 王连庆 李涛

[摘要] 间充质干细胞是一类具有自我更新与定向分化的干细胞，在组织修复与细胞生长发育中起重要作用。近期研究发现在间充质干细胞的发育过程中，部分长链非编码RNA表达上调与下调，表明它可能是间充质干细胞发育中的重要调控点，虽然目前该方面的功能性研究比较少，但其强大的研究潜力已经体现。

[关键词] 间充质干细胞；成骨分化；长链非编码RNA

[中图分类号] R34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）06（c）-0035-04

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新与定向分化能力的细胞，1966首次发现时被冠以“成纤维祖细胞”之名，目前已经证实它可以分化成骨骼、软骨组织、脂肪组织及肌肉等组织，并且在组织修复及细胞生长调节中发挥重要作用[1-2]。研究发现，MSCs通过分泌前列腺素E2（PGE2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1RA）、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-11（IL-11）等细胞因子及生长因子来影响免疫微环境，对损伤的组织进行修复[3]。不同于胚胎干细胞，MSCs属于成体干细胞，因此不具有无限自我更新和永生化能力[4]。基于以上理论基础，因此其修复调控机制显得尤为重要。

1 lncRNAs的概念及在干细胞发育分化中的作用

长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一类转录长度大于200 bp的非编码RNA，有的甚至超过10 kb，可以形成复杂的空间结构，表明它们参与基因表达调控的分子机制可能更加复杂。根据它们在基因组中的位置可以分为lincRNA、天然反义链lncRNA和内含子区lncRNA[5]。目前已经证实它们在转录水平及转录后修饰水平进行调控，对基因表达调控、肿瘤诊断及阐述其分子机制方面越来越受到人们的重视。近期研究发现，lncRNAs在干细胞多能性及分化等方面起关键调控作用，Guttman等[6]通过转录测绘技术与染色质免疫共沉淀技术共发现40条与多能干细胞功能相关的lncRNAs，其中有20余条与多能标志物转录因子（Nanog，oct4）基因表达相关，表明其在胚胎干细胞分化过程中起重要调控作用。同时，Chakraborty等[7]也鉴定出3条与维持多能干细胞特性的lncRNAs（Panct1-3）。在心肌细胞发育分化过程中，Wamstad等[8]也发现一条在其发育中起重要表观遗传调控作用的lncRNA。以上研究结果显示，lncRNAs在干细胞的生长发育及分化过程中起重要调控作用，研究其调控过程及发现新的长链非编码RNA势必为干细胞相关研究找到新的途径和方法。

2 间充质干细胞成骨分化过程中可能的最新调控策略

MSCs作为骨髓成骨细胞前体的重要来源，其分化增殖的时空特异性受到严格的调控。一般情况下，骨髓MSCs受遗传和表观遗传机制调控，但具体的分子机制有待阐明，MSCs向成骨细胞分化主要涉及以下几种信号传导通路：TGF6信号通路、MAPK通路、Runx/osteorix信号通路、Notch通路、Wnt通路等[9]。国外学者研究发现，如miR-125、miR-141及-200、miR-23等microRNA可通过抑制通路中Runx2蛋白等关键分子的表达对MSCs向成骨分化起抑制作用[10-11]；相反，miR-2861、miR-148b等[12-13]可通过激活成骨通路中关键分子，对成骨作用起正向调控。这些MSCs成骨调控因子构成一个复杂的调控网络，对其成骨过程进行精细调节。已有研究证实lncRNAs可作为一种竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与其他RNA转录本竞争相同的microRNA，从而抑制microRNA对其靶基因的调控，但其在MSCs成骨作用中调控microRNA的具体机制目前还未见报道。Ye等[14]发现，组蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM6B通过消除H3K9me3和H3K27me3甲基化修饰对MSCs成骨分化进行调控，表明通过表观遗传学机制，KDM4B和KDM6B可作为治疗靶点来控制MSCs分化过程，可为骨质疏松症等骨代谢疾病治疗找到新的线索。近期，研究发现一种转化生长因子β途径抑制剂（small molecular SB431542）可快速诱导胚胎干细胞产生MSCs[15]，这一发现表明MSCs可通过大量生产应用于临床治疗与修复，但其中的具体调控分子机制目前还不是十分明确。体内炎症微环境对MSCs的调节也非常重要，微环境中的免疫细胞和炎症因子可以活化MSCs，诱导其免疫调节功能。最近Dang等[16]学者发现炎症因子诱导的自噬可以对MSCs免疫功能产生影响，该发现使MSCs的临床治疗产生新的期望。总之，阐明MSCs的调控机制可对临床治疗及其成骨分化调控产生重大影响，lncRNAs作为近期发现的基因“富矿”，虽然在调控MSCs方面报道较少，但它应该在其细胞分化调控中发挥重要作用。

3 lncRNAs对间充质干细胞的调控作用

近年来，随着高通量测序技术的普及，lncRNAs的重要功能逐渐受到重视，lncRNAs可通过影响基因表达、表观遗传学修饰、蛋白质活性调节等方式对生命活动进行调控。

在MSCs向软骨分化过程中，Wang等[17]发现有3638个lncRNAs有较大程度的变化（2166个表达上调及1472个下调），作者选择了两个表达上调的lncRNA ZBED3-AS1和CTA-941F9.9进一步分析验证，结果表明它们在诱导分化后的第28天仍然持续高表达，提示可能参与了MSCs向软骨分化的全过程。罗嘉全等[18]利用生物分析软件分析了在MSCs成骨过程中成骨基因Smurf1、MSX1、BMP1相关的lncRNAs，包括uc003ups、AK096529、AK024937、AKl29811和K056311等。发现大多数lncRNAs在MSCs成骨分化后其表达均较分化前下调，其中3个lncRNAs（AK096529、uc003ups、AK056311）变化有统计学意义。其可能的机制是通过正向调控Smurf1，促使Smurf1表达下调，进而减少Runx2的降解，最终促进MSCs的成骨过程。左长清等[19]用基因芯片技术发现了116个在MSCs成骨过程中差异表达的lncRNAs，细胞实验进一步证实lncRNA AK089560的表达值在C3H10T1/2 细胞成骨分化的第2，4，6天明显下降，可能的机制是它参与维持MSCs处于未分化状态；进一步分析发现[20]，116个表达变化的lncRNAs中59个表达上调，57个则是表达下调；其中60.3%是基因间结构区域，另20.7%是位于编码区域；且24个lncRNAs都能找到相应的毗邻编码基因所匹配，提示它们可能是lncRNAs的调控目标基因。例如EGFR是成骨促进因子Runx2和Osterix的抑制物，小鼠lincRNA0231可通过调控表皮生长因子受体信号通路来负向影响成骨过程；lncRNA NR_027652则通过影响DLK1、lincRNA0243通过影响IL-5参与了MSCs的成骨过程。程晨等[21]发现在MSCs成骨过程中表达明显下调的lncRNAs有24条，细胞实验进一步证实其中AK035085可能通过对成骨过程中关键基因抑制来起作用。Wang等[22]同样用芯片技术发现了一些在成骨分化过程中的重要lncRNAs，最终证实lncRNA H19和uc022axw.1的表达上调可能参与了MSCs成骨分化的过程。Zhu等[23]报道，lncRNA-ANCR可以维持成骨细胞的非分化状态，其分子机制主要是通过与EZH2作用来抑制Runx2蛋白的表达，从而导致成骨分化降低；相反，下调lncRNA-ANCR则可促进成骨分化。

MSCs在不同的解剖区域有不同的生物学活性，Dong等[24]据此通过芯片分析了骨髓中MSCs和牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）中的lncRNAs表达差异情况，发现了457个表达上调及513个表达下调的lncRNAs。某些lncRNAs在PDLSCs中高表达，如NR 045555、NR 033651和NR 027621；另外一些则相比骨髓MSCs低表达，如NR 037182、NR 037595和 XR 111050。作者还同时检测了相关的mRNA表达情况，并用生物信息学技术构建起一个lncRNAs-mRNA模型，分析发现，这些lncRNAs可能通过影响相关mRNA的转录水平进而影响了诸如凋亡、MAPK、Wnt等复杂的信号通路，最终影响到细胞的凋亡、增殖与分化过程，它们很可能也参与了MSCs的成骨分化进程。

有报道称MSCs细胞有致瘤倾向，Shoshani等[25]发现lncRNA H19高表达，则这种倾向更明显，表明lncRNA H19可能在其成瘤分化中起到正向调控作用，它也可以成为MSCs致瘤过程中的一个潜在治疗靶点；Liu等[26]的研究成果表明lncRNA HOTAIR也参与了表皮-间质的转化过程。在骨髓瘤细胞向MSCs转化过程中，lncRNA MALAT1可通过影响LTBP3基因表达参与了整个转化过程[27]。这些研究一定程度上拓展了人们对lncRNAs在MSCs生物学功能影响方面新的认识。

4 小结与展望

基因的经典功能是编码对细胞生命活动至关重要的蛋白质，但是占基因绝大部分的非蛋白编码序列则是由包括micro RNAs、lncRNAs等在内的调控序列组成。随着二代测序技术和生物信息学技术的不断成熟，大量的lncRNAs被发掘出来，初期的研究成果已经表明，lncRNAs参与了细胞分化、个体发育等重要生命活动的整个调控过程，并与人类的诸多重大疾病密切相关。DNA元件百科全书（encyclopedia of DNA elements，ENCODE）计划已经在人类基因组中鉴定了9000余条lncRNAs，但其中具有明确生物学功能的仅有100条左右[28]，大量的基因“富矿”有待人类去开发。

相比其他细胞功能研究，lncRNAs在MSCs中的功能研究少之又少。但毋庸置疑，虽然前期研究仅停留在生物芯片与生物信息学分析层面，其强大的研究潜力已经呈现出来。基于lncRNAs在生命领域的强大功能，随着新的研究技术体系的建立，lncRNAs在调控间充质干细胞分化、增殖、凋亡等重要生命活动中的确切分子机制最终将得以阐释。

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（收稿日期：2015-03-31 本文编辑：苏 畅）