骨髓间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

陈丽燕++邓丽青++陈金花++钟郁++刘佳

摘 要：为优化骨髓间充质干细胞的分离和培养方法，采用改良的骨髓冲洗法分离骨髓干细胞，细胞接种后，比较不同体积分数胎牛血清（5%，10%，20%）、不同的DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM培养基，进行细胞培养，比较细胞生命状态。结果显示不使用筛网细胞分离细胞，应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12M培养基培养，能够提高培养效率。

关键词：间充质干细胞；骨髓；培养

中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）19-0200-02

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs）是指存在于骨髓基质中的非造血组织的间充质干细胞，在体内分布于多种组织和器官，并具有多向分化潜能。它有着广泛的来源，包括骨髓，骨骼肌，软骨，骨，肌腱等[1]。故在干细胞研究领域中具有突出的优势。本实验对小鼠BMSCs的生物学性进行研究，旨在建立体外分离培养BMSCs的方法，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提，进一步为组织工程、细胞治疗和基因治疗研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：6-8周龄SPF级昆明小鼠20只，體重30-40g （雌雄不拘），购自斯莱克景达公司，在本校标准化实验动物中心常规饲养。

主要试剂：DMEM/F12（Biological Industries公司）、H-DMEM培养基及L-DMEM 培养基（Sangon Biotech公司）、胎牛血清（FBS）（Sigma公司）、胰酶（GENVIEW公司）。

1.2 细胞分离方式

小鼠脱颈处死，置于75%无水乙醇的烧杯中浸泡5min，在无菌条件下取后腿股骨，清除表面肌肉组织。刺穿股骨，分别用DMEM/F12、H-DMEM或L-DMDM培养液（含10% FBS）冲洗骨髓，200目筛网过滤后，用1ml注射器注入细胞培养瓶，37℃，CO2培养。常规培养3～4天后用PBS冲洗两遍，全量换液去除非贴壁细胞。当细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰酶和0.01%EDTA消化，计数，传代。

1.3 细胞培养体系比较

（1）不同血清含量的比较：分离后的单个核细胞以1×106接种至6孔板中，用DMEM/F12培养液含5%，10%，20%FBS进行培养，比较细胞生长情况。

（2）不同类型培基比较：分离后的单个核细胞以1×106接种至6孔板中，用10%胎牛血清DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM分别培养，比较细胞贴壁与生长情况。

2 结果

2.1 细胞分离方式

使用筛网细胞残留少，培养时细胞密度过低，难以存活，BMSCs数量少（图1）；不使用筛网，可获取更多细胞，能使BMSCs贴壁与伸展，存活率明显高些（图2）。

2.2 细胞培养情况

2.2.1 不同血清浓度

用DMEM/F12培养液含5%，10%，20%FBS进行培养时，最佳的血清浓度是10%，细胞增殖旺盛，形态均一，易于传代。过高的血清浓度>15%时，会导致细胞出现分化的现象，传代较难。过低的血清会<10%时，导致细胞的增殖速度下降，未能增值传代。

2.2.2 不同类型培基

10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养按照1：1比例混合效果最佳，营养成分丰富，呈长棱形成纤维细胞样的细胞。（图3）10%胎牛血清的H-DMEM细胞培养，可见数个成纤维细胞样，细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质。（图4）。含10%胎牛血清的L-DMEM培养，仅见个别成纤维细胞样，细胞形态出现多样性，贴壁细胞浮起。（图5）

3 讨论

间充质干细胞来源于中胚层，具有很强的自我复制能力和多向分化潜能，它分布于全身各结缔组织，尤以骨髓中含量最多，但即使是在骨髓中，BMSCs的丰度也不高，每105-106个单核细胞中大约含一个BMSCs，并且随着年龄的增长，BMSCs含量逐渐减少[1]。BMSCs具有支持造血，促进造血干细胞移植后造血功能恢复、预防和减轻移植后的移植物抗宿主病的潜能[2，4]。因此，建立一个体外适宜BMSCs生长培养体系是显得至关重要。

MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。应用流式细胞仪分离法或免疫磁珠法，虽可以得到纯度较高的细胞，但成本昂贵，在分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。使用percol1分离液梯度离心的方法，能有效地将红细胞、白细胞，和间充质干细胞分离开来，同时操作简单，快速，对细胞的活性影响较小，但要是血管中细胞量少，分离得到的单个核细胞数量更少，不利于细胞的生长。贴壁法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法，至今仍是一种得到广泛应用的经典途径[3，5]。本实验采用贴壁培养法，并经过体外贴壁培养一段时间，通过换液去除悬浮生长的造血细胞，从而获得BMSCs。

在原代分离时，细胞分离方式中是否使用筛网对BMSCs的生长有一定影响，使用筛网细胞的密度过低，存活率难，BMSCs数量少；而无使用筛网细胞，能使BMSCs贴壁与伸展，存活率高，可获取更多细胞。最佳的血清浓度是10%，生长最为旺盛：血清浓度<10%，不利于细胞生长；血清浓度>15%时，易引起细胞分化而影响增值。应用L-DMEM培基未能获得可增殖传代的间充质干细胞，H-DMEM培基获得少量可增值传代细胞，而DMEM/F12和得到了均一的、可传代的间充质干细胞。

本实验对其分离、培养条件进行优化，结果显示不使用筛网细胞，应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12M培养基培养，能够提高培养效率。

参考文献

[1]张怡，赵连三，唐红，等.小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养[J].生物医学工程学杂志，2004，21（5）：746-748，765.

[2]宋一雪，王军，陈虎.间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用[J].现代生物医学进展，2009，9（5）：986-1000.

[3]裴瑛波.骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（14）：2775-2778.

[4]金建刚，冯凯，石炳毅，等.MSCs诱导移植物免疫耐受的研究进展[J].临床血液学杂志，2009，22：58-60.

[5]宫晓洁，孙莉，黎靖宇.小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及形态学观察[J].解剖学研究，2008，30（1）：54-56.endprint