抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达

李葱葱　李飞武　谭喜昌　夏蔚　邵改革　龙丽坤

摘要：利用生物信息学方法优化了适用于原核表达的Bar基因序列密码子，克隆了Bar基因序列并构建了pET28a-Bar融合表达载体，并转入大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）。结果表明，融合表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式表达膦丝菌素乙酰转移酶（PAT蛋白质），并通过镍离子亲和层析纯化后获得了PAT蛋白质，该纯化蛋白质的获得为利用酶联免疫法定量检测和筛选转基因植物提供了必要前提。

关键词：Bar基因；膦丝菌素乙酰转移酶；原核表达；分离纯化

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2515-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.058

Bar基因作为筛选标记基因，具有快速、简便、高效、转化细胞产生的假阳性个体少等优点，被广泛应用于转基因玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max）、油菜（Brassica campestris L.）、水稻（Oryza sativa L.）、小麦（Triticum aestivum Linn.）和大麦（Hordeum vulgare L.）植物基因工程研究中[1-3]。Bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），其能够使草丁膦的有效成分——膦丝菌素（PPT）失活，从而解除除草剂的毒性。Bar基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因[4]。目前，生物技术育种的阳性转化体筛选多数依据Bar基因表达的草丁膦除草剂耐受性进行表型鉴定筛选。而由于其不同时代单个转化体的外源基因表达稳定性未知，表型筛选易受环境等因素影响，导致了鉴定准确性不高。转基因植物标记基因的检测方法主要有表型鉴定、PCR鉴定、ELISA和Western印迹等方法[5]。ELISA分析法特异性高，获得结果快，仪器操作简单，同时可降低检测成本[6-8]。建立Bar基因原核表达体系，表达和纯化PAT蛋白质可为转基因转化外源蛋白质提供参考，本研究通过密码子优化和全基因合成，获得了适合原核表达的Bar基因片段，并分离纯化得到的高纯度PAT蛋白质，可作为抗原为制备多抗和单抗打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 原核表达载体pET28a （+）、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和大肠杆菌DH5α由吉林省农业科学院生物技术研究所转基因安全评价室保存。

1.1.2 酶及试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、引物Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG、十二烷基磺酸钠（SDS）和β-巯基乙醇购自Promega公司；Ni-NTA His Bind Resin、层析柱购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆基因片段 以合成引物PCR扩增Bar基因全长，然后用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ内切酶分别酶切pET-28a载体和扩增片段，将扩增片段连接pET-28a载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞。利用PCR扩增鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名为pET-Bar。提取质粒pET-Bar并转化到BL21（DE3）感受态细胞。挑取含pET-Bar质粒的单克隆菌落，接种于100 mL含有氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 ℃振荡培养过夜。次日用LB（Amp+）稀释至1 000 mL，37 ℃培养至OD600 nm为1.0左右，加IPTG 至终浓度为1 mol/L。37 ℃继续培养6 h后4 ℃、 5 000 r/min 离心10 min，收集沉淀并用PBS洗涤。

1.2.2 密码子的优化 利用SignalP 3.0 Server软件预测Bar基因序列有无信号肽及其位置；利用TargetP 1.1Server软件检测此信号肽的功能。将链霉菌中Bar基因密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将Bar基因密码子改造为大肠杆菌偏好密码子。

1.2.3 表达载体的构建 将含有目的基因的片段切下并用胶回收试剂盒回收，再与同样酶切处理的载体pET28a连接，并转化大肠杆菌DH5α，碱解法提取质粒，根据酶切鉴定结果，筛选含有Bar基因的重组质粒命名为pET28a-Bar。摇菌过夜培养，取1 mL菌液送北京鼎国昌盛生物技术公司测序以确定基因序列。

1.2.4 外源基因的诱导表达 将含有pET28a-Bar表达载体的BL21 （DE3）菌株于37 ℃活化过夜后，按4∶100稀释到20 mL含有60 mg/mL卡那霉素的LB培养基中。振荡培养至OD600 nm为0.6～1.0时，加入IPTG 至终浓度为0.6 mmol/L，再继续培养3 h后12 000 r/min离心5 min后收集菌体，用0.025 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）重悬菌体，12 000 r/min离心2 min收集菌体，置于-20 ℃备用。

1.2.5 诱导表达条件的优化 振荡培养至OD600 nm为0.6时，加入IPTG后2 h、5 h、过夜诱导，分别取出1 mL菌液，12 000 r/min 离心1 min 收集菌体，菌体置于-20 ℃备用。以SDS-PAGE 分析不同的表达时间对蛋白质诱导表达量的影响。菌液振荡培养至OD600 nm为0.6时，加入IPTG至终浓度分别为1 mmol/L，分别在37 ℃继续诱导5 h以上，其中在每隔1 h均取出1 mL菌液，12 000 r/min离心1 min收集菌体，用SDS-PAGE电泳分析最佳诱导表达时间。

1.2.6 目的蛋白质的纯化 取诱导表达3 h后的菌液，4 ℃、6 000 r/min 离心20 min收集菌体，将菌体破碎后分别收集可溶性和包涵体表达的PAT蛋白质，利用镍离子亲和层析柱纯化，可溶性表达的PAT蛋白质在非变性条件下纯化，包涵体形式的PAT蛋白质在变性条件下纯化。

2 结果与分析

2.1 密码子的优化

利用SignalP 3.0 Server软件预测Bar基因序列有无信号肽及其位置；利用TargetP 1.1Server软件检测此信号肽的功能。将链霉菌中Bar基因密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性将Bar基因密码子改造为大肠杆菌偏好密码子（图1）。

2.2 优化序列合成

序列确定后在基因的5′端引入BamH Ⅰ酶切位点，3′端引入Hind Ⅲ酶切位点，并加入保护碱基进行全基因合成。扩增Bar基因全长的引物：BarF：5′-CGCGGATCCATGTCTCCG-3′；BarR：5′-CCCAA

GCTTGATTTCGGTAAC-3′。分别用前1～14条和13～26条引物进行PCR扩增，把两次扩增后的产物各取1 μL做模板，用BarF和BarR引物进行基因全长扩增，PCR扩增产物见图3。测序结果表明，优化前后核苷酸序列同源性为79.89%，氨基酸（183个）同源性为100%。

2.3 pET28a-Bar表达载体的构建

将Bar基因片段和pET28a载体以BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，T4 DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α中，然后将阳性质粒pET28a-Bar转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，表达质粒pET28a-Bar酶切鉴定结果见图4。

2.4 Bar基因的原核表达诱导

挑取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，然后1∶100接种于含有氨苄青霉素LB液体培养基中，OD600 nm为0.4～0.6时加入IPTG振荡培养5 h诱导表达，将蛋白质进行SDS-PAGE电泳。结果（图5）表明，该重组表达载体表达外源蛋白质的最佳诱导时间为3 h，重组蛋白质存在于超声破碎的沉淀中，所以表达蛋白质为包涵体，为非可溶性的蛋白质。

2.5 PAT蛋白质的纯化

以包涵体形式PAT蛋白分别经镍离子亲和层析纯化（图6），纯化方法参考文献[9]，能得到清晰的单一条带，分子质量为27 ku，约占菌体总蛋白质的10%。

3 小结与讨论

选择标记基因被广泛用于转基因植物的研究，由于它们在转基因植物中出现频率很高，在转基因成分检测过程中，常被作为检测方法的靶标[10]。Bar基因作为除草剂筛选标记基因，具有高效、快速、简便等优点[11]。本研究结果表明，融合表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式表达膦丝菌素乙酰转移酶（PAT蛋白质），并通过镍离子亲和层析纯化后获得了PAT蛋白质，该纯化蛋白质的获得为利用酶联免疫法定量检测和筛选转基因植物提供了必要前提。

与高旭东等[13]、刘新光等[14]研究获得PAT蛋白质类似，该表达PAT蛋白质为非可溶的包涵体形式，本研究中获得的PAT蛋白质表达与其核酸密码子改造可能无直接相关[15]。而利用此表达蛋白质进行免疫学方法获得的PAT蛋白质单克隆抗体，为利用ELISA方法对Bar基因表达筛选的方法建立提供了技术支持，并有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 刘小红.Bar基因的转化及抗草丁膦除草剂转基因玉米植株的获得[J].沈阳农业大学学报，2007，38（1）：25-29.

[2] 邱 龙，马崇烈，刘博林，等.耐除草剂转基因作物研究现状及发展前景[J].中国农业科学，2012，45（12）：2357-2363.

[3] 孙 旭，苏 翔，凌 磊，等.农杆菌介导茎尖转化体系对不同基因型棉花转化率的影响[J].中国农学通报，2009，25（7）：62-66.

[4] 刘洪艳，弭晓菊，崔继哲. Bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性[J].生态学杂志，2007，26（6）：938-942.

[5] 许文涛，黄昆仑，邓爱科，等.转基因产品中PAT 蛋白的酶联免疫检测[J].农业生物技术学报，2006，14（2）：250-254.

[6] 郭 斌，祁 洋，尉亚辉.转基因植物检测技术的研究进展[J].中国生物工程杂志，2010，30（2）：120-126.

[7] 王 敏，张 亮，张 威，等.转基因作物pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究[J].分析化学，2013，41（10）：1555-1560.

[8] 李忠鹏，于寒松，胡耀辉，等.CP4-EPSPS夹心ELISA 配对单克隆抗体的研制和生物学特性分析[J].生物技术通报，2013（4）：206-209.

[9] HEROUER C，ESDAILE D J，MALLYON B A，et al. Safety evaluation of the phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat and bar sequences that confer to glufosinate-ammonium herbicide in transgenic plants[J]. Regul Toxicol Pharmacol，2005，41（2）：134-149.

[10] 岳运锋，吴 刚，武玉花，等.转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究[J].中国油料作物学报，2011，33（3）：280-289.

[11] 杨朝国，杨方方，张登峰.抗除草剂草丁膦转基因玉米后代筛选方法的研究[J].作物杂志，2010（6）：32-35.

[12] 武淑香，姜志磊，孔祥梅，等.抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立[J].分子植物育种，2008，6（1）：156-160.

[13] 高旭东，王永志，时圣凤，等.膦丝菌素乙酰转移酶的表达及单克隆抗体制备[J].细胞与分子免疫学杂志，2013，29（5）：500-503.

[14] 刘新光，梁念慈，马涧泉.重组人CK2β亚基的原核表达纯化与鉴定[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（2）：201-205.

[15] DAVID A M，TATA R，AGHA R，et al.Crystal structure of a putative phosphinothricin acelyltransferase （PA4866） from pseudomonas aeruginosa PAC1[J].Proteins，2005，61（3）：677-679.