魔芋芋花叶病毒的检测

盛佳婧 钟琳 杨朝柱 胡凯 王大平 吴金平 胡中立 刁英

摘要： 为评价魔芋（Amorphophallus konjac）体内芋花叶病毒检测方法，利用人工接种芋花叶病毒的魔芋作为试验材料，分别采用DAS-ELISA、RT-PCR、荧光定量PCR等3种方法进行检测。结果表明，对于人工接种芋花叶病毒1周，植株出现有明显病征的魔芋，荧光定量PCR检测的灵敏度最高、RT-PCR次之，而DAS-ELISA酶联检测法灵敏度较低。

关键词：魔芋（Amorphophallus konjac）；芋花叶病毒；DAS-ELISA；RT-PCR；荧光定量PCR

中图分类号：S436.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2519-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.059

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科魔芋属多年生草本植物，已有2 000多年的种植历史[1]。魔芋是世界上迄今为止发现的惟一含有大量葡甘聚糖的植物。近年来随着葡甘聚糖营养保健功能的逐步被发现和在食品工业上的广泛应用，魔芋产品的市场需求逐年扩大，但因常年无性繁殖，使病毒积累、種性退化，其丰产性和品质无法保证[2]。芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）是天南星科植物上发生最普遍和危害最严重的病毒[3]。

目前植物病毒的检测方法主要包括生长季隔离检疫、指示植物接种、血清学检测、免疫电镜和分子生物学检测[4，5]。已报道用ELISA和RT-PCR法来检测魔芋中芋花叶病毒[6]。荧光定量PCR是在常规PCR基础上将荧光共振能量转移与荧光标记探针结合，将核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技术，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、准确定量等特点[7]。实时荧光定量PCR技术被广泛应用于医学诊断、海关检验检疫、国防军事、新型农业、基础研究等领域[8，9]，尤其在动物医学病理和分子生物学研究领域应用十分广泛[10]。

本研究在前人研究的基础上，结合植物病毒检测的特点，采用DAS-ELISA、RT-PCR和荧光定量PCR对魔芋中的芋花叶病毒进行检测，为魔芋病毒的快速诊断提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

芋花叶病毒由华中农业大学洪霓教授提供，接种材料为组培得到的清江花魔芋（A. konjac cv. qingjiang）脱毒植株。

1.2 试剂

植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；5×M-MuLV反转录酶缓冲溶液、M-MuLV 反转录酶购自Promega公司；dNTPs、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase、DL2000 Marker购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DSMV ELISA 试剂盒购自美国Rapidbio公司；2×SYBR Master Mix购自TOYOBO公司。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列测定由上海桑尼生物科技股份有限公司完成。

1.3 病毒的接种

将带病毒的新鲜魔芋叶片用液氮研磨至粉末后溶解于接种缓冲液（5 mL PBST，0.1 g PVP-40，

0.005 g BSA，0.022 5 g 铜试剂）中，并用纱布过滤到1.5 mL EP管中，插入冰水中备用。接种前洗净手指，用干净的钢丝球沾取带病汁液在健康魔芋叶片上摩擦，接种后用无菌水冲洗叶面，去除缓冲液对叶片代谢的影响。接种1周后魔芋叶片出现白色斑点，叶片边缘出现轻微卷边的症状（图1），说明芋花叶病毒已经成功接种到健康魔芋植株上。

1.4 病毒的检测

1.4.1 DAS-ELISA检测 称取0.3 g的带病叶片，加入到3 mL PBS（pH 7.4）溶液中，用匀浆器将标本充分匀浆，离心20 min收集上清。按照ELISA试剂盒的步骤进行操作，测定405 nm 波长下的OD值。数据判断标准：阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照平均值≤0.10，临界值计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。阴性判定标准：样品OD405 nm<临界值者为阴性；阳性判定标准：样品OD405 nm≥临界值者为阳性。

1.4.2 RT-PCR 检测 参考文献[6]合成检测引物（5′-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3′，5′-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3′），扩增的目的片段长度为310 bp。采用植物总RNA提取试剂盒提取魔芋叶片总RNA，具体方法依照说明书进行。PCR体系采用25 μL反应体系进行，包括cDNA 1.5 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），dNTPs 0.5 μL（10 mmol/L），10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2 μL（25 mmol/L），Taq DNA酶1 U，ddH2O 15.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，36个循环；再72 ℃延伸5 min。PCR产物以1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，并将PCR产物送至上海桑尼生物科技股份有限公司进行序列测定。

1.4.3 荧光定量PCR检测 以cDNA（稀释100倍）为模板进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR反应体系为20 μL，包括cDNA模板2 μL、2×SYBR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL（20 μmol/ L）。PCR 反应程序：95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。每个样品设定3个平行，反应在ABI实时荧光PCR 仪上进行。

2 结果与分析

2.1 DAS-ELISA检测结果

DAS-ELISA检测结果如图2所示。由图2可以看出，阳性对照1和7的OD405 nm分别为2.987 1、3.172 3；阴性对照2和8的OD405 nm分别为0.080 2、0.073 5；空白对照6的OD405 nm是0.070 2；平行样品3、4、5的OD405 nm分别为0.981 7、0.706 7、0.123 4；平行样品9、10、11、12的OD405 nm分别为1.020 6、0.119 3、0.103 6、0.105 2。虽然接种芋花叶病毒的魔芋叶片有稍许颜色反应，但达不到检测试剂盒要求的阳性标准，DAS-ELISA检测的灵敏度较低。

2.2 RT-PCR检测结果

接种芋花叶病毒的魔芋能扩增到预期大小的条带（图3），而健康魔芋样本无此片段出现。BLAST比对结果表明，本研究中扩增的序列与DsMV其他株系的对应序列覆盖率可达到100%，相似性最高达到99%，说明所得DNA片段确为DsMV的基因片段。

2.3 荧光定量PCR检测结果

荧光定量PCR检测了稀释100倍的病毒样品，检测到荧光信号，25个循环数左右达到平台期，条带特异性较强，能确定是目的序列扩增（图4）。结果表明，荧光定量PCR能够检测魔芋花叶病毒。

3 小结与讨论

基于免疫学原理的ELISA相关方法对设备要求低、操作简单、成本偏低，可用于基层大量样品的检测等优点，广泛用于病毒的检测，但往往非特异性反应（即假阳性）的问题较普遍，对于某些材料的检测灵敏度也不够高。本研究中接种病毒的植株已经明显出现的病症，但采用ELISA方法进行检测，却并未得到可靠的阳性结果。基于分子生物学技术的RT-PCR方法在反应特异性和灵敏度方面大大提高，而且没有免疫学方法中制备抗血清的限制，检测的时间较短，但对于带毒量偏低的材料仍有其局限性。荧光定量PCR技术是最近几年发展最快的技术之一，是由荧光技术和普通PCR扩增系统相结合，克服了普通PCR技术的不足，且简化了检测过程，特异性和灵敏度都较高，可以用于带毒量偏低的带病植株的分子检测。本研究中荧光定量PCR的模板浓度比RT-PCR低100倍，仍然能够检测出阳性结果，表明荧光定量PCR的灵敏度确实优于RT-PCR。但是荧光定量PCR检测对仪器要求较高，需要专门的荧光定量PCR仪，而RT-PCR在普通的PCR仪上就能进行，一般实验室即可以开展检测工作。

参考文献：

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