FSHβ基因与公鹅精液品质性状的关联分析

孙海森，刘胜军，李建磊，蒋再慧，崔广佳，孙超，潘增涛，张莹

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

黑龙江省的肉鹅饲养量和鹅绒产量一直位列全国前茅。在鹅的饲养管理中，繁殖率低一直是制约养鹅业发展的重要问题，其中公鹅精液品质差是造成繁殖率低的一个重要因素，表现为精子密度低、畸形率高、精液量少等等，且鹅群中精液质量变异较大[1]。所以，在鹅的饲养中，为保证种蛋受精率，公鹅饲养量较大，公母鹅配比较低，由此提高了饲养成本，降低了养殖效益。

从遗传上提高种公鹅的繁殖力和精液品质，是从根本解决该问题的方法[2]。 FSH（Follicle Stimulating Hormone，卵泡刺激素）是一种糖蛋白类促性腺激素，由动物垂体前叶嗜碱性细胞分泌，促进性腺中类固醇激素的生成和配子的发育[3]。在人类中，FSH 作用于睾丸曲细精管中的支持细胞来刺激精子成熟，可以与睾酮协同作用调节支持细胞的功能，而支持细胞对精细胞有支持和营养的作用，调节精子的发生并构成血睾屏障[4-5]。FSH 可解离成α 和β 两个亚基。

目前已经有很多研究将FSHβ 基因作为与家畜精液品质相关的候选基因。Dai（2009）等发现FSHβ亚基基因外显子3 上4453 A＞C 突变导致103 位丝氨酸变为精氨酸，此突变会降低牛精液质量和受胎率[6]。韩厚明等[8]研究了鸡FSHβ 亚基基因5’调控区的单核苷酸多态性，检测发现该区域存在6 个SNP位点，即G-494A，T-470A，A-464G，-450 处插入碱基A，A-405G，A-361G，位点与鸡早期产蛋性能有关。牛晓童[6]发现外显子FSHβ 外显子3 的C126T 突变与皖西白鹅和莱茵鹅产蛋量有关。

FSHβ 亚基基因由3 个外显子和2 个内含子组成，其中外显子1 在cDNA 5’UTR 区域，只有外显子2 和部分外显子3 参与编码氨基酸。鹅FSHβ 亚基基因mRNA 序列长396 bp（GenBank：EU563910.1），编码131 个氨基酸（GenBank：ACC97141.1）。鹅与鸡的FSHβ 亚基基因mRNA 同源性为96%（NCBI blastn在线程序比对）。鸡的FSHβ 基因编码的氨基酸中前20 个为信号肽序列，其余111 个位成熟蛋白质。

鉴于以上FSHβ 基因对精子发生发育及雌禽的繁殖性能等的重要作用，研究旨在揭示FSHβ 基因的多态性与公鹅精液品质、精子活力等性状变异的内在关系，探索影响鹅精液品质差异的遗传机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用10～11月龄公鹅143 只。群体来自黑龙江省大庆市北方种鹅场。对公鹅进行采精训练2周后，按照腹背式按摩法进行人工采精，测量每个个体的精液体积、精子密度、精子畸形率和精子活率4个指标。4 个指标的测量方法，与之前发表的文章相同[1]。

1.2 试验方法

对所有试验公鹅翅下静脉采血，ACD 溶液抗凝，所得血样-80 ℃保存。使用全血基因组DNA 提取试剂盒（北京博尔诚科技有限公司）提取所有公鹅的DNA 样本。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术检测FSHβ 基因SNP（C126T）位点的多态性，对该位点分型使用的是 Sequenom 公司的MassARRAY iPLEX 软件平台（Sequenom，San Diego，CA）。检测试验中使用了两个PCR 引物和一个延伸引物，序列见表1。

表1 基因分型所使用的引物序列Table 1 Primer sequences of the genotyping

SNP 位点的选择是参考相关文献，同时比对NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库内基因信息得到的，并记录SNP 附近约200 bp 左右的参考序列，用于飞行质谱检测中引物的设计。

1.3 统计分析方法

基因频率、基因型频率的计算，以及H-W 平衡的检测是使用SAS 8.0 软件中的FREQ 过程实现的（SAS Institute Inc.，Cary，NC）。利用SAS 8.0 软件中的GLM 过程分析基因型多态性与精液品质性状的关联性，数学模型如下：

Y=μ+S+G+e

其中，Y 为受试个体精液品质性状的表型值，μ为试验群体平均值，S 为家系的固定效应，G 为基因型的固定效应，e 为随机误差。

4 个精液品质性状的相关性检验是使用SAS 8.0软件中的CORR 过程实现的。

2 结果与讨论

经检验，FSHβ 基因内含子2 的126 位点存在一个C/T 突变，该位点在试验143 只公籽鹅中的基因频率和基因型频率见表2。试验群体在该位点有三个基因型：CC，CT 和TT，其频率分别是0.08，0.44 和0.48。并且SNP（C126T）位点在试验群体中处于Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。说明该群体在该位点未经选择。

表2 FSHβ-C126T 位点基因频率和基因型频率及Hardy-Weinberg 平衡检验Table 2 Gene and genotype frequencies of SNP（C126T）in FSHβ gene and Hardy-Weinberg equilibrium test

由表3 可见，精液体积与精子活率呈显著正相关（P＜0.05），精液体积与精子密度、精子密度与精子活率呈显著负相关（P＜0.05）；其他精液品质性状之间无显著相关性（P＞0.05）。

表3 精液品质性状之间的相关性Table 3 Correlation analysis among the different semen quality traits

从表4 中可以看出，SNP（C126T）位点的三种基因型对精液品质性状有不同影响。精液体积方面，TT型显著高于CC 型和CT 型（P＜0.05）；精子密度方面，CC 型和TT 型显著高于CT 型（P＜0.05），CC 型和TT型之间差异不显著（P＞0.05）；精子活率方面，TT 型和CT 型之间差异不显著（P＞0.05），但显著高于CC 型（P＜0.05）；三种基因型的精子畸形率无显著差异（P＞0.05）。

表4 SNP 基因型与性状的关联分析结果Table 4 Association analysis of SNP（C126T）and semen quality traits

研究在鹅FSHβ 基因内发现单核苷酸多态位点SNP（C126T），并且该位点的不同基因型与鹅精液品质性状存在显著相关关系。这说明FSHβ 基因会影响鹅的繁殖性能，这与牛晓童的研究结论一致[7]。SNP（C126T）位于FSHβ 基因的第2 内含子。有大量研究表明，内含子的多态性会影响基因表达水平，如果蝇和人类的内含子突变可引起基因表达的变化[8]。Jungerius 的研究表明IGF2 基因的三个内含子中的可调控基因表达，最终影响猪的脂肪与肌肉的沉积[9]；雌激素受体基因（ESR）内含子1 的突变可增加产仔数[10]；另外，赵要风等利用PCR-RFLP 方法检测香猪FSHβ 亚基基因的多态性，发现其内含子1 存在BamH1 酶切位点，可导致猪的产仔数增加[11]。

2005年，陈少康等用17 条引物筛选了吉林白鹅关于公鹅繁殖性能的分子标记，结果条带多态率90.63%，平均每条引物能够扩增出9.41 个片段[12]。这样的结果说明，调控公鹅的遗传机制还很复杂。在研究中，由于籽鹅基因组序列尚未完成测序，序列信息不足，也可能造成试验误差。这使得对于鹅的繁殖力研究更加困难。

综合以上精液品质之间的相关性和SNP（C126T）位点与精液品质性状之间的关联分析结果，初步判断在FSHβ 基因第2 内含子126 位点，TT 型为影响籽鹅精液品质的优势基因型，推测在SNP（C126T）位点是纯合TT 型的公鹅个体精液品质更佳，繁殖力更强，结果为提高公鹅繁殖力和精液品质的遗传研究提供了重要的参考信息。

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