基于气相色谱－质谱技术对用咪康唑处理的白念珠菌的代谢组学研究

杨 宇，王 慧，曹颖瑛，朱臻宇（第二军医大学药学院，.药物分析学教研室；.新药研究中心，上海 200433）

随着免疫功能低下患者的增加、器官移植等医疗技术的发展以及免疫抑制剂的使用，真菌感染率居高不下，其中白念珠菌成为真菌感染的主要病原菌［1］。

咪康唑因生物利用度好和不良反应少成为防治真菌感染的一线药物。研究表明，咪康唑可通过影响过氧化物酶和线粒体而发挥抗真菌活性［2］。同时，咪康唑可增加活性氧使细胞死亡［3］。然而，目前咪康唑的作用机制尚不明确，因此研究其作用机制显得尤为重要。

在生命系统中，代谢组能将基因组、转录组和蛋白组的微小变化放大。因此，代谢组学能更直接地反应生物体的功能变化。

笔者基于气相色谱－质谱（GC－MS）代谢组学技术，研究咪康唑给药前后白念珠菌的代谢特征谱，结合药物作用机制，探讨代谢物产生差异的原因，为阐明药物作用机制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Thermo Trace Ultra／DSQⅡGC－MS（美国赛默飞公司）；微型漩涡混合仪（美国赛默飞公司）；－80℃低温冰箱（美国赛默飞公司）；冻干机（美国Virtis公司）；MJx型智能霉菌培养箱（宁波江南仪器厂）。

1.2 试剂 甲氧基胺盐酸盐、N－甲基－N－（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、咪康唑均购自Sigma公司；正庚烷（上海晶纯实业公司）。

1.3 菌株和培养基 白念珠菌SC5314；YPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，溶解于1 000ml三蒸水，高压灭菌（121 ℃，15min），4 ℃保存。

2 方法

2.1 真菌培养

2.1.1 咪康唑半数抑菌浓度（IC50）的确定 挑取白念珠菌单克隆，接种至1ml YPD培养液，于30℃，200r／min培养至指数生长后期，于紫外分光光度计600nm［4］下测菌液光密度（D）值，用 YPD培养液调整菌液浓度至D值为0.1，取20ml加入各锥形瓶中培养，至D值为0.2时，给药组中加入咪康唑，使其终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64μg／ml，继续培养（对照组中加入相同体积的二甲基亚砜，其浓度应小于0.05%，以确保不影响白念珠菌的生长），分别在3、4、5、6h测定各组的D值。与对照组的D值相比，选择继续培养4h，其中咪康唑的IC50为16μg／ml。

2.1.2 培养条件 按照IC50的测定方法和给药浓度，培养给药组和对照组各6份。

2.2 样品前处理

2.2.1 样品淬灭 向样品中加入等体积的60%甲醇（预冷至－20 ℃），迅速摇匀，静置5min（－40℃），6 000r／min离心。

2.2.2 样品提取 样品用超纯水迅速清洗后，重悬于1ml沸水（含10μl 200mmol／L的α－氨基丁酸内标）［4］，静置15min，放入 －80 ℃ 冰箱冰 冻15min，取出，60℃水浴溶解15min，再重复冻融操作2次，13 200r／min离心，取上清液，放置在－20℃冰箱预冻。后置于冻干机中冻干，获得冻干粉。

2.2.3 衍生化 向冻干粉中加入75μl甲氧基胺盐酸盐／吡啶溶液，40℃温孵90min，再加入75μl MSTFA 溶液 （1%TMCS），40 ℃ 温孵 50min，13 200r／min离心，取上清液，装入进样小瓶。

2.2.4 菌体干重的测定 将样品沉淀在室温下风干至恒重，称样品干重，至少称量3次以确保样品完全干燥。

2.3 GC－MS条件 毛细管柱：HP－5MS石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；进样口温度：260℃；升温程序：起始温度为70℃，保持3min，4℃／min升至220℃，再8℃／min升至310℃，保持10min，图谱从第7.6分钟开始采集；载气：高纯氮气；流速：1.0ml／min。进样量为1μl。

电子轰击源（EI）；离子源温度：200℃；接口温度：280℃；电子能量：70eV；调谐方式：标准调谐；质谱扫描方式：扫描范围15～800amu，扫描速度5s／dec。

2.4 数据处理 将原始数据（.RAW）经Xculibur数据处理系统转化成CDF格式，利用XCMS软件对数据峰校正和峰积分，并采用 MATLAB 7.0（The MathWorks，Inc.，USA）过滤离子峰，留下相同保留时间下峰度最大的离子峰。为校正质谱响应，每个样品的各个峰面积先除以各自的细胞干重，再除以内标衍生化后峰度最大的离子峰。利用SIMCA－P V 11.0（Umetrics，Sweden）软件将数据中心化和帕累托变换，标准化后进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS－DA）分析，根据variable influence in the projection（VIP）值来预测代谢物对模型的贡献程度。VIP＞1的数据对模型有明显贡献。接着对数据进行独立样本t检验，保留P＜0.01的数据。将数据与NIST数据库匹配，并用标准品定位，得到潜在的生物标志物。

3 结果

3.1 GC－MS色谱图 给药组和对照组白念珠菌的胞内代谢物，经提取，衍生化后进样分析，其GC－MS色谱图，如图1所示。

图1 给药组和对照组的GC－MS色谱图

3.2 PCA与PLS－DA结果 数据校正后，对给药组和对照组进行PCA和PLS－DA分析，如图2A和2B所示，结果表明两组明显分开。其载荷图和S－plot图，如图2C和2D所示。载荷图用于潜在生物标志物的筛选，根据载荷图所示，离原点越远的离子对分类贡献越大。得到23个潜在的生物标志物，给药组和对照组代谢物含量变化见图3。

4 讨论

根据给药组和对照组的差异代谢物实验结果，分别讨论如下：

4.1 葡萄糖 给药组与对照组相比，葡萄糖含量显著升高。研究表明咪康唑通过影响线粒体ATP酶和钾离子泵而发挥抗真菌活性［5］，其中钾离子泵是主动运输，消耗能量，而葡萄糖可产生能量。因此，葡萄糖含量的升高可能与咪康唑作用钾离子通道有关。

图2 给药组和对照组的主成分分析图（A）、偏最小二乘法得分图（B）、载荷图（C）和S－plot图（D）

图3 给药组和对照组的差异代谢物柱状图

4.2 海藻糖 白念珠菌受到外界刺激时会采取保护性防御机制，其中氧化应激刺激细胞内非还原性二糖海藻糖明显增加［6］。在本实验中，咪康唑可能是一种氧化应激，给药后使细胞内海藻糖大量积累，从而起到抗氧化的作用。

4.3 三羧酸循环相关代谢物 三羧酸循环不仅是需氧生物体重要的代谢途径，还是糖类、脂质和氨基酸代谢联系的枢纽。酸刺激下，胞外谷氨酸通过反向转运体（GadT）转移至胞内，在谷氨酸脱羧酶的作用下生成γ－氨基丁酸（GABA），该反应消耗氢离子，使胞内pH值升高。进而GABA通过GABA支路在GABA／α－酮戊二酸氨基转移酶的作用下脱氨基形成琥珀酸半醛（SSA），SSA在琥珀酸半醛脱羧酶的作用下生成琥珀酸，进而影响三羧酸循环［7］，同时GABA支路可降低细胞内活性氧［8］。这与前期的研究结果相符［9］。由此可知，三羧酸循环中琥珀酸和柠檬酸含量的降低可能与咪康唑影响GABA支路有关。

4.4 2－羟基戊二酸（2－HG） 研究表明，2－HG脱氢酶活性降低导致2－HG大量积累，而2－HG脱氢酶可降低DNA和组蛋白的甲基化，从而抑制正常细胞向癌细胞转化［10］。因此，咪康唑给药组2－HG的大量积累可能与2－HG脱氢酶活性降低有关，从而促进正常细胞向癌细胞转化。

4.5 氨基酸类 天冬酰胺、天冬氨酸、酪氨酸在给药组中含量升高。其中，酪氨酸磷酸化参与细胞信息传递，因此酪氨酸的增加可能与细胞信息传递有关。天冬氨酸和天冬酰胺可合成多种氨基酸。有研究表明，苏氨酸生物合成中间体β－天冬氨酸半醛（ASA）的积累对细胞有一定的损伤作用，同时可加速Gcn4的降解，Gcn4可调控多种氨基酸和维生素的生物合成［11］。因此丙氨酸、二甲基甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量的降低与咪康唑促使ASA积累有关。

4.6 磷酸、磷酸甘油、甘油类 磷脂是细胞膜的重要组成部分。Pasrija等［12］报道药物外转运蛋白倾向定位于细胞膜。因此，咪康唑可能通过影响细胞膜而导致药物外转运蛋白的活性降低，使细胞内的药物积累而发挥治疗作用。

本实验基于GC－MS的代谢组学方法对咪康唑给药前后白念珠菌的代谢物进行研究，经比较分析，得到23个潜在的生物标志物，它们主要参与了氨基酸代谢、三羧酸循环、氧化应激、糖酵解和磷脂代谢等相关通路，对咪康唑抗真菌作用机制的阐明具有重要意义。

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