纸基-表面增强拉曼光谱法快速鉴别染色南五味子药材

张国庆，李 丹，王科兵（.解放军69医院药剂科，湖南衡阳400；.第二军医大学药学院，上海00433）

纸基-表面增强拉曼光谱法快速鉴别染色南五味子药材

张国庆1，李 丹2，王科兵1（1.解放军169医院药剂科，湖南衡阳421002；2.第二军医大学药学院，上海200433）

目的采用纸基-表面增强拉曼光谱法（SERS）对染色南五味子进行快速鉴别。方法选用浸泡法制备的银胶纸作为SERS基底，擦拭经乙醇-水溶液润湿的南五味子，银胶纸立即进行SERS检测；先后对银溶胶的浓缩倍数、银胶纸的SERS增强效果及稳定性等因素进行考察。结果成功鉴别低浓度酸性红、赤藓红染色的南五味子。结论纸基-SERS法可实现非法染色南五味子的快速、准确、无损的鉴别，有望应用于快检领域。

表面增强拉曼光谱；银胶纸；南五味子；非法染色

南五味子（Kadsura longepedunculata Finet et Gagnep）俗称红木香、紫金藤、紫荆皮，是木兰科植物华中五味子（Schisand ra sphenanthera Rehd et W ils）的干燥成熟果实［1］，可做药用，植株可供观赏。近年来，南五味子非法染色现象多有报道，不法商贩选用颜色相近且便宜易得的染料进行染色掺伪以达到以次充好的目的，此现象严重危害患者的用药安全。因此，尽快建立一种能快速、准确、简便鉴别染色南五味子的方法很有必要。

目前，染色五味子的鉴别方法有外观鉴别、薄层色谱法（TLC）［2-5］，高效液相色谱法（HPLC）及其联用技术［2-5］、二级管阵列技术［5］及紫外光谱法（UV）［2］等。TLC法操作简单，但仅适用于初步筛选；HPLC及其联用技术法准确度高，但样品前处理过程较为烦琐，且药材的基质成分可能干扰检测；近年来兴起的表面增强拉曼光谱（SERS）技术具有选择性好、灵敏度高等优点，可实现色素快速、无损的鉴别［6-8］。笔者以染色南五味子为研究对象，选用浸泡法制备的银胶纸作为SERS基底，成功鉴别了经低浓度酸性红和赤藓红染色的南五味子。先后对银溶胶的浓缩倍数、银胶纸的SERS增强效果及稳定性等因素进行系统考察，以期建立染色南五味子的快速、准确、无损的鉴别方法。

1 仪器与试剂

1.1仪器 KQ-250DB型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；离心机；紫外分光光度计TU-1901（北京普析通用仪器有限责任公司）；蔡氏扫描电镜（EVO MA-10，Germany）；i-Raman（BWS415，B＆W Tek，USA），激发波长为785 nm，分辨率为5 cm－1。

1.2试剂和样品 硝酸银、柠檬酸三钠和无水乙醇为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）；定量滤纸（杭州特种纸业有限公司）；纯净水；酸性红、赤藓红和罗丹明6G（R6G）（阿拉丁试剂公司）；南五味子购于药店（产地：陕西汉中）。

2 实验部分

2.1染色南五味子的制备 精密称取R6G、酸性红和赤藓红粉末各3 mg，分别溶解于3 m l纯净水，振荡溶解，即制得浓度为1 mg／m l的染料标准溶液，其余浓度溶液通过逐级稀释获得。取适量南五味子进行模拟染色，浸泡染色6 h后烘干待用。

2.2银溶胶及银胶纸的制备

2.2.1 银溶胶的制备［9］精密称取45 mg的硝酸银，加入少量去离子水使其溶解，后移至250 m l的容量瓶中定容；不断搅拌上述溶液并将其加热至沸腾，量取5 m l浓度为1%的柠檬酸钠溶液，逐滴加入到沸腾的硝酸银溶液中，保持溶液沸腾并继续加热60 min，反应结束后冷却至室温并置于棕色瓶中避光保存。

2.2.2 银胶纸的制备 分别量取2、3、5 m l上述银溶胶置离心管中，分别配平后离心10 min（8 000 r／min）；离心后分别移去1、2、4 m l的上清液，剩余银溶胶超声数分钟，即可制得浓缩2倍、3倍、5倍的银溶胶。取定量滤纸，将其浸泡于原始浓度及上述浓缩后的银溶胶中，避光24 h后取出，于50℃烘箱中烘干待用。

2.3染料标准SERS谱的获得 用移液枪移取1μl 0.1 mg／m l的R6G、酸性红及赤藓红标准溶液，滴加于优化过的银胶纸上，对滴加区立即进行SERS检测，即获得染料的标准SERS谱。

2.4染色南五味子的SERS检测 用移液枪移取25μl的乙醇-水混合溶液润湿染色药材表面数秒，用干燥的银胶纸擦拭药材的润湿区域数秒，对单次擦拭后的银胶纸立即进行SERS检测。

3 结果与讨论

3.1SERS基底的制备及表征

3.1.1 银溶胶的紫外表征 利用紫外-可见分光光度计测试上述新制备银溶胶的吸收谱，结果见图1。如图所示在421 nm处呈现单个吸收峰，这是典型的银溶胶的紫外吸收峰［10，11］，可推测银纳米粒子以球体为主，且粒径在50 nm左右。

3.1.2 银溶胶浓缩倍数对SERS增强效果的影响 取定量滤纸若干张，分别量取20 m l原始浓度、浓缩2倍、3倍、5倍的银溶胶进行浸泡，避光24 h后取出，室温干燥备用。选取0.1 mg／m l的R6G作为探针对银胶纸的增强效果进行考察，取1μl该溶液点于新制的各银胶纸上，对点样区立即进行SERS检测，选用1 511 cm－1处的特征峰强度［12］作为标准比较增强效果，将3次检测的峰强的平均值做柱状图，如图2所示。浓缩3倍的银溶胶浸泡制得的银胶纸增强效果最好；且浓缩倍数超过3倍时，增强效果有所减弱。

图1 银溶胶的紫外表征图谱

图2 1μl（1mg／m l）R6G在银胶纸上增强效果比较图

另外，采用下述公式估算银胶纸的增强因子（EF）［13］：

其中，I表示1 511 cm－1处的拉曼峰强度，N表示沉积于基底上的R6G的分子数；下标R和S代表拉曼和SERS。用图2的数据估算，银胶纸的增强因子分别是1.9×102、3.1×102、8.4×102和7.7×102，可以看出浓缩3倍的银溶胶制备基底时EF较高，因此，选择浓缩3倍的银溶胶进行银胶纸的制备。

3.2银胶纸保存稳定性的考察 选取0.1 mg／m l的R6G作为探针考察储存10 d银胶纸的增强效果的变化，同样取1μl该溶液点于浸泡浓缩3倍的银溶胶所制得的银胶纸上，点样区立即进行SERS检测。同样选用1 511 cm－1处的特征峰强度作为标准比较（图3），3次检测的平均强度与存放时间（d）的关系如图4所示：制备5 d内的银胶纸增强效果略有降低，但基本保持稳定，因此新制的SERS基底在5 d内使用较好。

3.3非法染色南五味子的鉴别 采用纸基-SERS法检测市售南五味子，滴加25μl乙醇-水混合溶液润湿药材表面数秒，取银胶纸擦拭后进行SERS检测，检测结果见图5。空白银胶纸的光谱与市售药材的擦拭检测光谱几乎完全相同，且未见后述的染料特征峰，说明南五味子未被后述染料染色。0.1 mg／m l的赤藓红及酸性红的标准SERS谱见图6。用OPUS软件进行特征峰的标示后发现赤藓红在409、472、766、1 165、1 239、1 274、1 327、1 611 cm－1等多处存在特征峰；随后进行模拟染色南五味子的擦拭检测，染色样品的擦拭检测图谱（图7）在437、469、1 165、1 239、1 274、1 611 cm－1等多处也存在赤藓红的特征峰，可见该法可快速判别赤藓红染色的南五味子；随后，检测1、0.1、0.05 mg／m l酸性红染色的南五味子，结果见图8。分析步骤同上，通过比较酸性红标准SERS谱及染色样品的擦拭检测图谱，可以进行快速判别。另外，0.1 mg／m l染料染色前后南五味子无明显颜色变化，但仍可检测出SERS信号，因此纸基-SERS可基本满足快速鉴别染色药材的需要。

图3 1μl（0.1 mg／m l）R6G滴于不同保存时间银胶纸上所得SERS检测图谱

图4 保存10 d银胶纸的增强效果变化图

图5 空白银胶纸（a）及市售南五味子（b）的SERS检测图谱

图6 0.1mg／m l赤藓红（a）和酸性红（b）染料溶液的标准SERS检测图谱

图7 银胶纸检测被不同浓度赤藓红染色的南五味子的擦拭检测图谱

图8 用银胶纸检测被不同浓度酸性红染色的南五味子的擦拭检测图谱

4 结论

笔者采用纸基-SERS法成功鉴别了低浓度酸性红和赤藓红染色的南五味子；先后对银溶胶的浓缩倍数、银胶纸的SERS增强效果及稳定性等因素进行系统考察。另外，优化银胶纸的干燥和保存时间以延长其“保质期”将成为今后研究的方向之一。笔者相信，随着研究的不断深入，所建立的纸基-SERS法将为染色中药材的鉴别及中药材质量监督提供一种新的快速而可靠的分析方法。

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Rapid identification of dye adulteration in Kadsura longipedunculata by paperbased SERS

ZHANG Guoqing1，LIDan2，WANG Kebing1（1.Department of Pharmacy，No.169 Hospital of PLA，Hengyang 421002，China；2.School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo establish a paper-based surface-enhanced Raman scattering（SERS）method for the detection of dyed Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.MethodsSupported silver nanoparticles on filter paper were synthesized simply by soakingmethod.In addition，factors including enrichment ratio of silver nanoparticles，the enhancementeffectand stability of the SERS devicewere investigated.ResultsThe Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep，dyed by Erythrosine or Acid Red at low concentration had been detected successfully.ConclusionCombined w ith the paper device and SERS，the approach was rapid and non-destructivewhich could be used to identification of dyed Kadsura longipedunculata FinetetGagnep.

SERS；Ag NPs-paper；Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.；dyeing adulteration

R917

A

1006-0111（2015）03-0213-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.006

2015-02-13

2015-04-14

［本文编辑］顾文华

科技部重大科学仪器设备开发专项（2012YQ180132）

张国庆，本科，副主任药师.研究方向：医院药学和临床药理.Tel：13017175511；E-mail：pla169yyyxk＠163.com