黎药裸花紫珠在小鼠体内止血活性部位的研究

易 博，张 旻，林 海，陈 涛，徐文彤，冯世秀（.解放军87医院药剂科，海南海口5759；.深圳市中科院仙湖植物园，深圳市南亚热带植物多样性重点实验室，广东深圳58004；3.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌700）

黎药裸花紫珠在小鼠体内止血活性部位的研究

易 博1，张 旻2，3，林 海1，陈 涛2，徐文彤1，冯世秀2（1.解放军187医院药剂科，海南海口571159；2.深圳市中科院仙湖植物园，深圳市南亚热带植物多样性重点实验室，广东深圳518004；3.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100）

目的确定黎药裸花紫珠的止血活性部位，为其止血活性成分的研究提供依据。方法裸花紫珠经醇提获得醇提物（EtOH-extract）、醇提物经大孔吸附树脂处理分别获得水洗脱物（HP-H2 O-elution）和乙醇洗脱物（HP-EtOH-elution），将EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2 O-elution分别配制成高、中、低剂量的供试药物，云南白药为阳性对照。每日给小鼠灌胃1次，在连续给药7 d后，记录小鼠体质量的变化，采用断尾法和玻片法测定小鼠的出血时间和凝血时间，并以此为筛选指标对各部位止血效果进行评价。结果与模型对照组相比，HP-EtOH-elution对缩短小鼠出血时间的作用效果显著，并且其低剂量组和中剂量组的效果均优于阳性对照组。EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2 O-elution在缩短小鼠的凝血时间和增加小鼠的体质量方面，效果均不显著。结论裸花紫珠的止血活性成分主要集中在醇提物经大孔树脂处理后的乙醇洗脱部位，并且可能是通过影响内源性凝血途径发挥止血作用。

裸花紫珠；活性部位；出血时间；凝血时间；小鼠

裸花紫珠（Callicarpa nudif lora Hook et A rn）是马鞭草科紫珠属植物，别名紫珠草、止血草、贼仔叶白花茶等，为我国海南黎族同胞的习用药材［1］。分布于海南、广东、广西等省，目前海南多地有大面积栽培种植，尤以海南五指山产的为上品。裸花紫珠主要取地上干燥部分入药，具有止血消炎、散瘀消肿、解毒、祛风湿之功效，民间主要用于治疗创伤出血、呼吸道及消化道出血、化脓性炎症等，外用治烧、烫伤及外伤出血［2，3］。我院前身之一解放军162医院在上世纪六七十年代已经将裸花紫珠运用于临床，在烧、烫伤救治等方面取得良好效果［4，5］。现代研究表明，裸花紫珠主要含有黄酮、鞣质、萜类和酚类等成分［6-13］，其中总黄酮提取物具有抗血栓形成、降低全血黏度、抑制血小板凝集和抗炎等作用。目前市场上的裸花紫珠成药主要为其水提物浸膏制成的片剂、胶囊等，在临床应用中，裸花紫珠片口服对肛肠病、鼻腔鼻窦、流产和上环等术后止血作用效果显著［14，17］。然而，针对裸花紫珠不同溶剂提取部位的止血活性和止血机制却鲜有报道。为了明确裸花紫珠止血活性的部位及效果，本研究以裸花紫珠地上部分的醇提物、醇提物经大孔吸附树脂处理后获得的水洗脱物和醇洗脱物制备成供试药物，经小鼠灌胃给药后，测定药物对小鼠的止血作用及给药期间小鼠体重的变化［18］。本研究最终将明确裸花紫珠止血作用的活性部位，为下一步止血活性成分和止血机制的研究提供依据。

1 材料

1.1试药 裸花紫珠药材（地上部位全株，于2013年4月采于海南省五指山，经深圳市中科院仙湖植物园陈涛研究员鉴定，自然风干备用）；云南白药（4 g装，云南白药集团股份有限公司，国药准字Z53020798）；HP-20大孔吸附树脂（日本三菱化工集团）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2样品制备 裸花紫珠1.0 kg，粉碎，经70%乙醇于70℃水浴锅回流提取3次，每次提取1 h，合并提取液并过滤，滤液于旋转蒸发仪减压浓缩获得醇提总浸膏（EtOH-extract 125.0 g）。取总浸膏80.0 g水溶解后经大孔吸附树脂柱处理，依次用水和95%乙醇洗脱，分别洗脱3个柱体积，合并洗脱液，减压浓缩成浸膏状，分别获得HP-H2O-elution 26.0 g和HP-EtOH-elution 48.0 g。

EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2O-elution浸膏冷冻干燥，各取10.0 g，用DMSO-蓖麻油（1∶1）配制成浓度为0.5 g／m l的储备液；临用前，以0.5%CMC-Na稀释为相应剂量浓度。

1.3动物 昆明种SPF级KM小鼠，♀♂各半，体质量（20±2）g，由广州中医药大学（大学城）实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0020。饲养环境恒温20℃，恒湿50%。饲料用60Co照射过，达SPF级。

2 方法

2.1对小鼠出血时间的影响 小鼠110只，♀♂各半，称量体质量，用苦味酸标记［19］。按照给药方案共分为模型对照组（0.5%CMC-Na）、阳性对照组（云南白药，0.667 g／kg）以及EtOH-extract、HPEtOH-elution和HP-H2O-elution 3个给药组，每个给药组分低、中、高3个剂量组（0.5、1.0、2.0 g／kg），试验小鼠为每个剂量组10只，♀♂各半。采用灌胃法给药1次／d，按小鼠体质量计算灌胃量［20，21］：0.01 m l／（g・d），连续7 d，测定前再次记录每只小鼠的体质量。试验组在第7天给药后1 h，采用断尾法测定出血时间［21-23］。具体操作：剪去鼠尾5.0 mm，自血液流出时开始计时，每隔10 s用滤纸轻轻拭血1次，直到拭后不再出血为止。从开始出血至停止出血，记录所用时间即为小鼠出血时间。

2.2对小鼠凝血时间的影响 分组及给药情况同“2.1”项，末次给药后1 h，选取玻片法测定凝血时间［23-25］。具体操作：采用眼眶取血法用眼科弯镊迅速摘取一侧眼球，在洁净载玻片的两端各滴1滴直径为5～8 mm的血滴，立即计时［20］。每隔15 s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻拨动1次，并观察有无血丝（纤维蛋白丝）挑起［25］。从采血开始至挑起血丝，记录所用时间即为小鼠凝血时间，另一滴血平行试验。

2.3统计学方法 各组数据使用SPSS 19.0统计软件，检验方差齐性，并进行One-Way ANOVA分析差异的显著性［26］，数据以均数±标准差（¯x±s）表示。

3 结果

3.1裸花紫珠提取部位对小鼠体质量的影响 给药7 d后，计算给药前后小鼠体质量的变化。将EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2O-elution低、中、高3个给药浓度下小鼠体质量的增加值与模型对照组体质量增加值比较，各组小鼠体质量的变化没有明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05），呈平稳增长趋势。试验结果见表1。

3.2裸花紫珠提取物对小鼠出血时间和凝血时间的影响

3.2.1 对小鼠出血时间的影响 与模型对照组比较，EtOH-extract中、高2个浓度对试验小鼠的出血时间无明显影响（P＞0.05），低剂量组对其有一定的缩短作用（P＜0.05），但与阳性对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）。与模型组比较，HPEtOH-elution各剂量组可明显缩短小鼠的出血时间，整体差异显著，其中低、中剂量组的效果非常明显（P＜0.001），高剂量组次之（P＝0.01）；并且低、中剂量组的出血时间均小于阳性对照组，其作用效果较阳性对照更为明显（P＜0.05，P＝0.001）。与模型对照组比较，HP-H2 O-elution各剂量组也可不同程度地缩短小鼠的出血时间，其中中剂量组的出血时间缩短最为显著（P＜0.001），相比较而言低剂量和高剂量组出血时间缩短程度较小（P＜0.05）；与阳性对照组相比，只有中剂量组的出血时间有明显的缩短（P＜0.01）。试验结果见表1。

3.2.2 对小鼠凝血时间的影响 EtOH-extract、HP-EtOH-elution和HP-H2 O-elution低、中、高3个给药浓度的凝血时间与模型组比较，均无显著影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。仅阳性对照药组比模型对照组凝血时间缩短较明显（P＜0.05）。表明裸花紫珠各提取物对小鼠的凝血时间没有显著影响。试验结果见表1。

表1 裸花紫珠提取物对小鼠体质量、出血时间和凝血时间的影响（n＝10，¯x±s）

4 讨论

在上述止血活性试验中，出血时间（BT）是指穿破毛细血管，自出血到自然止血所需的时间，其止血时间长短与毛细血管功能、组织收缩力、组织因子、血小板的数量和功能等因素相关，影响最大的是血小板和毛细血管功能，凝血因子次之；而凝血时间（CT）是指血液自离体至凝固所需的时间。血液离体后，接触带阴电荷的表面（玻璃器材）时，因子被激活，其后一系列凝血因子相继活化，最后使纤维蛋白原转化为纤维蛋白而凝血，其时间的长短主要与各种凝血因子的含量和凝血活性有关［26］。在药物止血化瘀功效的研究中常以上述2个指标作为考察对象，不仅常用于单味药材提取物的止血或者活血活性部位的筛选，为进一步明确相关活性成分及其作用机制提供了一定的实验依据［9，25，26］，而且也多应用于研究复方制剂和单一组分止血药物的止血效果及有效剂量［24，27］。血液凝固可分为内源性凝血途径和外源性凝血途径，两条途径相互联系，同时进行［28］。在更为深入的止血机制研究中，还需结合血浆凝血酶原时间PT（用于检测机体外源性凝血系统）和活化部分凝血活酶时间APTT（用于检测机体内源性凝血系统），用于开发安全有效的止血制剂和产品。

本研究的止血试验结果表明，裸花紫珠提取物有一定的止血作用，其中以大孔吸附树脂处理后95%乙醇洗脱部位对出血时间的缩短作用最为明显，其效果更是优于阳性对照药（云南白药）；裸花紫珠提取物对凝血时间均无显著影响。裸花紫珠70%乙醇提取物经过大孔吸附树脂柱处理，将提取物分为两个部位，水洗脱物和醇洗脱物，其中水洗脱物主要是大分子的多糖类、蛋白质、氨基酸等水溶性成分，而醇洗脱物则主要集中了裸花紫珠的次生代谢产物，包括糖苷类成分［7，29］。由以上初步活性试验结果可以推测，裸花紫珠止血的活性成分主要是其次生代谢产物，并且可以通过大孔吸附树脂法进行富集。结合前期文献对裸花紫珠凝血途径的研究，表明其化学成分可明显缩短家兔活化部分凝血活酶时间（APTT），由此推测提取物可能是通过影响内源性凝血途径来发挥止血作用［1，9］。因此，本研究明确了裸花紫珠止血作用的活性部位，推测可能是通过内源性凝血途径起效，并在低浓度下体内无毒，为下一步分离和鉴定止血的有效成分提供了依据。

［1］ 戴好富，梅文莉.黎族药志（第一册）［M］.北京：中国科技出版社，2008：192-193.

［2］ 广东植物研究所.海南植物志（第4卷）［M］.北京：科学出版社，1977：531

［3］ 中国医学科学院药用植物资源开发研究所，中国医学科学院药物研究所，北京医科大学药学院，等.中药志（第5册）［M］.北京：人民卫生出版社，1994：1471.

［4］ 解放军162医院.裸花紫珠的临床应用（一）［J］.中草药通讯，1972，2：42-44.

［5］ 解放军162医院.裸花紫珠的临床应用（二）——裸花紫珠治疗烧伤75例疗效初步观察［J］.中草药通讯，1972，3：41-44.

［6］ 蔡金平，董 琳，关薇薇，等.裸花紫珠的研究进展［J］.现代药物与临床，2012，27（1）：60-64.

［7］ 九芝堂股份有限公司.一种裸花紫珠提取物及其制备方法、制剂和用途［P］.中国，CN101623394A，2009-01-12.

［8］ 张 洁，柳文媛，冯 锋.裸花紫珠的化学成分研究［J］.海峡药学，2010，22（9）：77-79.

［9］ 张 洁，李宝泉，冯 锋，等.裸花紫珠的化学成分及其止血活性研究［J］.中国中药杂志，2010，35（24）：3297-3301.

［10］ 王祝年，韩 壮，崔海滨，等.裸花紫珠的化学成分［J］.热带亚热带植物学报，2007，15（4）：359-362.

［11］ 梁纪军，徐 凯，李留法，等.裸花紫珠总黄酮的抗炎、止血作用研究［J］.现代中西医结合杂志，2009，18（26）：3161-3162.

［12］ M eiW L，Zhuang H，Cui HB，et al.A new cy totoxic iridoid from Callicarpanudiflora［J］.Nat Prod Res，2010，24（10）：899-904.

［13］ Liang JJ，Qi JL，Li L，etal.Flavonoids from Callicarpanudiflora leaves［J］.Chem Nat Compd，2011，47（1）：110-111.

［14］ 杨远姗.裸花紫珠片的临床应用进展［J］.临床合理用药，2012，5（9）：151-153.

［15］ 倪海峰，赵淑英.裸花紫珠片用于上环后止血的临床观察［J］.基层医学论坛，2012，16（26）：3426-3427.

［16］ 席作武，高宗跃，牛明了.裸花紫珠片治疗肛肠病术后出血128例［J］.陕西中医，2009，30（9）：1155.

［17］ 段晓东，汪淑英，李晓静，等.裸花紫珠片在鼻腔鼻窦术后止血的临床应用［J］.中国伤残医学，2009，17（3）：59-60.

［18］ 薛 焱，王同智.蒙药材阿给（冷蒿）止血活性部位的药效学筛选研究［J］.青岛医药卫生，2012，44（1）：40-42.

［19］ 张玉萍，余 琼.三七素的止血活性及其神经毒作用实验研究［J］.山东中医杂志，2010，29（1）：98-99.

［20］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2001：179-185.

［21］ 王 杉，青桂玲，韦 颖，等.白花九里明提取液对小鼠出血时间、凝血时间和血小板数量的影响［J］.广东医学，2012，33（9）：1228-1230.

［22］ 陈新谦，金有豫，汤 光.新编药物学［M］.16版.北京：人民卫生出版社，2007：569.

［23］ 李仪奎.中药药理实验方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，2006：684.

［24］ 刘 萍，刘文波，张 婧，等.仙脉通胶囊对小鼠出血时间和凝血时间的影响［J］.中医药信息，2012，29（6）：40-41.

［25］ 金松今，张红英，朴惠顺.桃仁乙醇提取物对小鼠出血时间和凝血时间的影响［J］.延边大学医学学报，2010，33（2）：98-99.

［26］ 吴久健，孟岳良，邹俪华，等.白及不同提取部位对小鼠止血活性实验［J］.药学实践杂志，2011，29（3）：206-207.

［27］ 郭雪婷，杨晓君，王 颖.复合红花黄色素抗凝血作用研究［J］.新疆农业科学，2012，49（9）：1759-1763.

［28］ 白东鲁，陈凯先.高等药物化学［M］.北京：化学工业出版社，2011：1017-1019.

［29］ 董 珂.大孔树脂技术在中药研究中的应用概况［J］.药学实践杂志，2006，4（1）：13-16.

Screening for the hemostatic active extractsof Callicarpa nudiflora，inmice in vivo

YIBo1，ZHANG M in2，3，LIN Hai1，CHEN Tao2，XU Wentong1，FENG Shixiu2（1.Department of Pharmacy，No.187 Hospital of PLA，Haikou 571159，China；2.Key Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity，Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518004，China；3.College of Life Science，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

ObjectiveTo screen the hemostatic active extracts from Callicarpa nudif lora.MethodsThe powdered Callicarpa nudif lora was extracted w ith 70%EtOH and concentrated to give EtOH-extract.The EtOH-extract was further chromatographed over HP-20 macroporous resin column，eluting w ith aqua and 95%EtOH to get HP-H2O-elution and HPEtOH-elution，respectively.The obtained three extracts of EtOH-extrract，HP-EtOH-elution and HP-H2O-elution were set as large，middle and small dosage groups for drug preparation，respectively.Yunnan Baiyao was used as a positive control group.Theweight increment，bleeding time and clotting time of fed micewere detected by cutting tailand grass slidemethods after intragastric administration for 7 days.ResultsAs compared w ith blank model and positive control，each dosage groups of HPEtOH-elution could significantly shortened the bleeding time，ofwhich the small dosage group andmiddle dosage group even exhibited better results than the positive controlgroup.Whereas the EtOH-extract，HP-EtOH-elution and HP-H2O-elution didn′t demonstrated significanteffecton clotting time aswell as theweight increment.ConclusionThe HP-EtOH-elutionwas suggested to be themajor active extract possessing hemostatic activity tomice under tested dosages.The hemostaticmechanism may through intrinsic coagulation pathway.This study would be helpful for further phytochemical investigation of C.nudiflora.

Callicarpa nudif lora；active extracts；bleeding time；clotting time；m ice

R965

］ A

1006-0111（2015）03-0235-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.011

2013-10-27

2014-05-22

［本文编辑］ 陈 静

2013年海南省中药现代化专项基金资助（ZY201328）

易 博，博士，副主任药师.研究方向：中药现代制剂与医院药学.Tel：0898）65920079；E-mail：boyicn＠126.com

徐文彤，副主任药师.Tel：（0898）65920988；E-mail：yjk_187＠163.com