中国北方人群NBN基因外显子SNPs分布及其与乳腺癌的关系

金 鑫，金紫凝，牛亚梅，金 峰，佟伟民*

(1．海南省公安厅 刑警总队， 海南 海口 570203； 2.中国医科大学附属第一学院 乳腺外科， 辽宁 沈阳 110001； 3.中国医学科学院 基础医学研究所 病理学系， 北京 100005)



研究论文

中国北方人群NBN基因外显子SNPs分布及其与乳腺癌的关系

金 鑫1，金紫凝2，牛亚梅3，金 峰2，佟伟民3*

(1．海南省公安厅 刑警总队， 海南 海口 570203； 2.中国医科大学附属第一学院 乳腺外科， 辽宁 沈阳 110001； 3.中国医学科学院 基础医学研究所 病理学系， 北京 100005)

目的探讨NBN基因与中国北方人群乳腺癌的相关性。方法对188例正常人及205例乳腺癌患者NBN基因的16个外显子进行直接测序。结果在中国北方人群乳腺癌样本中未发现NBN基因突变。对基因频率大于5%的NBN基因SNPs进行分析，发现rs709816 (D399D, A>G)的AG基因型较AA基因型发生乳腺癌的风险增加2.34倍，有显著的统计学差异，提示该SNP与乳腺癌的发生相关。结论NBN基因第10外显子内SNP rs709816(A>G)可能与中国北方人群乳腺癌发生相关。

DNA修复；NBN；单核苷酸多态性；乳腺癌

DNA损伤随时发生在个体的细胞核内，DNA损伤应答反应(DNA damage response，DDR)在维持人类基因组稳定性方面起着重要作用[1]。哺乳类生物体内存在高效的DNA损伤检测机制(sensor)、损伤发生后的信号传导系统(transducer)和修复损伤的效应蛋白系统(effector)， 协同作用维持基因组的

稳定性。精确的DNA损伤后修复对于抑制发生于特定基因外显子损伤后小片段核苷酸缺失、插入所引起的基因的突变，保证哺乳类个体长寿命是至关重要的[2]。NBN是1997年发现的肿瘤易感性人类染色体断裂综合征(Nijmegen breakage syndrome，NBS，OMIM 251260)的致病基因，其主要临床表现为小头畸形，肿瘤易感性增加(主要为淋巴瘤和脑肿瘤)；实验室检查表现为染色体断裂、DNA损伤修复缺陷及辐射敏感性增加[3]。NBN基因产物Nbs1蛋白主要与Mre11、Rad50相互作用形成Mre11-Rad50-Nbs1(MRN)复合物，在DNA损伤应答反应中作为检测DNA损伤发生的蛋白，通过调节ATR-CHK1或ATM-CHK2通路修复DNA单链或双链损伤[3]。NBS患者主要分布在高加索人群，特别是捷克和波兰部分地区，近期研究亦表明italic突变与人类肿瘤发生具有密切的相关性[4]。本研究的目的是进一步了解italic突变和SNPs与中国北方人群乳腺癌的相关性。

1 材料与方法

1.1 DNA准备

中国北方188例正常人和205例乳腺癌患者外周血DNA来自中国医科大学附属第一临床学院乳腺外科，参与者均签署知情同意书(中国医科大学科伦审2015- 107- 2)。乳腺癌诊断按WHO分类标准为侵袭性导管癌153例，小叶癌28例，黏液癌7例，其他17例，中高分化。患者年龄33～78岁(平均年龄48岁)。应用Qiagen试剂盒提取外周血基因组DNA。患者及正常人群均没有乳腺癌家族史。

1.2NBN基因测序

NBN基因位于人类染色体8q21.3，全长89.9kb。检索ENSEMBL人类基因组数据库 (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens)，获得italic全基因序列。应用Primer 5.0设计引物，通过PCR方法扩增涵盖italic启动子、全部16个外显子和外显子/内含子衔接区的DNA片段；PCR产物经凝胶纯化回收后，应用ABI3730XL测序仪测序分析(北京北方基因组赛诺测序中心)。测序结果经 CodonCode Aligner分析；存在DNA变异的序列经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和BLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)人类基因组数据库进行比对分析，确定突变的性质和方式。

1.3 统计学分析

确认正常对照和乳腺癌患者NBN基因单核苷酸(SNP)基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡分析后，对其基因型-乳腺癌风险应用非线性回归评估其odds ratios(ORs)值和95%可信区间。

2 结果

2.1 中国北方人群NBN基因SNPs的分布

通过对188例中国北方正常人群NBN基因外显子测序后，发现了4个外显子SNPs基因频率大于5%，包括rs1063045 (L34L)、rs1805794 (E185Q)、rs709816 (D399D)和rs1061302 (P672P)(表1)。与NCBI/UCSC数据库相比较，中国北方人群NBN基因的外显子基因频率大于5%的SNPs发现数目要少，可能与样本量偏小相关。

2.2 中国北方乳腺癌患者NBN基因突变及SNPs分析

对205北方乳腺癌患者NBN基因外显子测序分析，没有发现NBN基因的突变。进一步对外显子编码区SNPs分析，发现rs1063045 (L34L)、rs1805794 (E185Q)、rs1061302 (P672P)3种SNPs的基因频率的分布与正常人群对照相比较无明显差异(表1)。

表1 中国北方正常人群及乳腺癌患者NBN基因SNPs分析

而NBN基因外显子10中的rs709816(A>G)基因型分布明显与乳腺癌相关。与rs709816基因型AA相比较，携带AG基因型女性乳腺癌发生风险增加2.34倍(95% CI 1.34～4.07)，有显著的统计学差异(表1)。而GG基因型携带者的乳腺癌风险为正常人的1.93倍(95% CI 0.93～4.02)，但无显著统计学差异。

3 讨论

家族性NBS患者其基因italic突变可导致小头畸形并伴发神经、淋巴及其他系统肿瘤[4]，近期的研究表明NBN基因突变也存在于散发性神经系统肿瘤如小脑的髓母细胞瘤、大脑部位的胶质母细胞瘤[5]、肝细胞肝癌及胆管细胞癌[6]、肺癌及结肠癌[7]。已有研究表明位于NBN基因3′-UTR的SNP 924CC与高加索人乳腺癌发生相关[8]，但中国北方人群散发乳腺癌发生是否与NBN基因突变或SNPs相关尚未见报道。本研究采用外显子测序的方法对中国北方乳腺癌患者的NBN基因进行分析，未发现NBN基因的突变。对基因频率大于5%的SNPs进行分析发现，rs709816(A>G)的AG与GG基因型较AA基因型发生乳腺癌的风险相应增加2.34～1.93倍，提示该italic的SNP与乳腺癌的发生具有相关性。由于本研究所采用的样本量偏低，可能一些SNPs的检出率没有达到NCBI数据库所注册的标准，但在该样本量下检出NBN基因SNP rs709816(A>G)与中国北方人群乳腺癌具有显著相关性，而在其他人群及不同肿瘤中均未见报道，提示rs709816(A>G)基因型的变化可能在中国北方人群乳腺癌的发生有一定作用。增加样本量及其相关的机制研究有助于进一步确认NBN基因SNP与乳腺癌的相关性。

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Association betweenNBNpolymorphismsandbreastcancerinnorthChinese

JIN Xin1, JIN Zi-ning2, NIU Ya-mei3, JIN Feng2, TONG Wei-min3*

(1.Dept. of Criminal Investigation, Hainan Provincial Public Security, Haiko 570203；2.Dept. of Surgical Oncology and Breast Surgery, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001；3.Dept. of Pathology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China)

Objective To investigate the relationship between mutations/ polymorphisms ofNBNandbreastcancerinnorthChinese. Methods Direct sequencing of PCR product was used to detect the mutation and SNPs ofNBNin205breastcancersandin188normalcontrols. Results There was noNBNmutationtobefoundinallbreastcancerpatients.FourmajorNBNpolymorphismsweredetected,andrs709816 (D399D,A>G)ofitalicwassignificantlyassociatedwithriskofbreastcancer.Comparingtors709816genotypeAA,AGgenotypewasassociatedwithsubstantiallyincreasedriskofbreastcancerinnorthChinese(oddratio=2.34, 95%confidenceinterval=1.34-4.07). Conclusions Current evidence suggests that the SNP rs709816(A>G)in italic may contribute to the risk of breast cancer in north Chinese.

DNA repair; NBN; SNP; breast cancer

2015- 09- 19

2015- 10- 27

中国医学科学院基础医学研究所所院长基金(2008097)；教育部博士点基金(20091106110022)

1001-6325(2015)12-1645-03

R737.9

A

*通信作者(corresponding author)：：wmtong@ibms.pumc.edu.cn