miR- 95对结肠癌细胞系SW620侵袭和迁移的影响及机制

王超超，向 征*，杜昆利，王朝义，汤为学

(重庆医科大学附属第一医院 1.胃肠外科； 2.实验研究中心, 重庆 400016)



研究论文

miR- 95对结肠癌细胞系SW620侵袭和迁移的影响及机制

王超超1，向 征1*，杜昆利1，王朝义1，汤为学2

(重庆医科大学附属第一医院 1.胃肠外科； 2.实验研究中心, 重庆 400016)

目的探讨小分子非编码RNA- 95(miR- 95) 表达对结肠癌细胞系SW620侵袭、迁移能力的影响及其机制。方法将miR- 95干扰慢病毒转入结肠癌细胞系SW620,用qRT-PCR检测细胞中miR- 95表达，用Transwell小室和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力；MTT法检测细胞同种、异种细胞黏附能力；用 Western 印迹检测3组细胞的EMP1,VEGFC和MMP2蛋白表达。结果SW620转染miR- 95干扰慢病毒72 h后，转染率较高；与空病毒组和对照组比较，转染组miR- 95的表达降低(P<0.05)；侵袭和迁移能力减弱(P<0.05)；同种黏附能力增强 (P<0.05)；异种黏附能力减弱 (P<0.05)；同时转染组EMP1蛋白表达明显增高，VEGFC、MMP2蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论miR- 95能够促进SW620细胞侵袭和迁移能力，可能是通过EMP1、VEGFC和MMP2实现的。

miR- 95；结肠癌；侵袭；迁移；EMP1

结直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一，全球每年至少有 120 万人患结直肠癌，约有 60 万人死于该疾病[1]。近年来，发现了一类在真核生物中起转录后调控作用的小分子非编码 RNA(miRNA)， 对细胞的增殖、分化、凋亡与转移等具有重要作用[2]。 miR- 95是微小 RNA 家族成员，研究表明miR- 95在多种人类恶性肿瘤中表达增高，作为促癌基因参与肝癌和胰腺癌等[3- 4]的发生、发展。研究发现上皮膜蛋白 (epithelial membrane protein1，EMP1)在结肠癌和肺癌[5- 6]中的表达降低，促进肿瘤发生、发展，由此推测 EMP1 在肿瘤的形成和发展中具有重要作用。miR- 95与EMP1、VEGFC和MMP2在结肠癌中的关系尚无报道，本研究拟通过体外实验，研究干扰miR- 95表达对结肠癌细胞迁移、侵袭和黏附能力的改变及对细胞中EMP1、VEGFC和MMP2蛋白表达的影响, 探讨miR- 95与EMP1、VEGFC和MMP2在结肠癌发生、发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和细胞系

SW480、HCT116、 LOVO 、HT29和 SW620人结肠癌细胞系(重庆医科大学附属一院中心实验室)；Trizol 试剂(Invitrogen公司)；胎牛血清(Hyclone公司)； All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒和All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR primers(Gene Copoia公司)；RPMI1640培养液(Sigma公司)；miR- 95干扰慢病毒和miR- 95空载体(上海科维创生物科技有限公司)。兔抗人EMP- 1、VEGFC和MMP2(Abcam公司),辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG (武汉三鹰生物技术有限公司)。Matrigel基质胶 (BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组、处理:用含10%胎牛血清和青-链霉素双抗的 RPMI1640培养基培养5株结肠癌细胞,取对数增殖期的细胞进行实验。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中的miR- 95表达:按说明书提取RNA、 反转录， 再进行qRT-PCR,以 U6为内参照，采用Gene Copoia公司的All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit微小RNA 检测试剂盒，反应模式：预变性 95 ℃ 10 min；变性 95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 20 s；延伸 72 ℃ 10 s，共40个循环。样本miR- 95的表达结果用2-△△Ct值代表待测样本基因表达量相对于校准样本基因表达量的倍数，所有样本均有3 个复孔。

1.2.3 细胞转染:实验分为转染组、空载组和对照组。每孔接种 3×105个SW620细胞于3个6孔培养板中。细胞培养至汇合约 60%时按说明书将 miR- 95干扰慢病毒和病毒空载体转染入细胞。转染72 h后荧光显微镜下观察计算转染率，培养数天后提取细胞总RNA，qRT-PCR检测转染效果。成功转染细胞在37 ℃，5% CO2的孵箱中培养，供后续实验使用。

1.2.4 Transwell 小室检测3组细胞侵袭、迁移变化:实验分组同前，侵袭实验将Matrigel胶用7倍体积的无血清培养液稀释，取60 μL加于每个小室的内膜上，摇晃使胶液均匀平铺在小室膜上，紫外线照射过夜。加400 μL的细胞悬液到上室，加600 μL含10%新鲜胎牛血清的培养液到下室。37 ℃， 5% CO2条件下培养，观察有细胞穿透到下室时，终止实验。用棉签擦去 Matrigel胶后，用PBS液清洗，4%多聚甲醛固定， 0.1%结晶紫染色 10 min，PBS清洗，100倍显微镜下拍照，随机选择 5个视野计数，取平均值。迁移实验不加Matrigel 胶到上室内膜，其他与侵袭实验相同。

1.2.5 划痕实验: 实验分组同前。细胞转染后待细胞汇合90%时，用无血清 RPMI1640 培养液饥饿培养24 h，然后用 20 μL移液枪枪头,在每孔中心轴进行划痕并摄片(0 h), 37 ℃ 5% CO2条件下培养 24 h摄片。实验重复 3 次。

1.2.6 MTT法检测各组细胞同种、异种黏附能力: 用人脐静脉内皮细胞- 926(HY926)作为异种细胞，用MTT法检测各组细胞之间及各组细胞与HY926细胞间的吸光度A值，计算异(同)种黏附率=[异(同)种各时间段A值-异(同)种空白组A值)]/转染组或空载体组A值。反映各组同种、异种细胞黏附能力。

1.2.7 Western 印迹法检测3组细胞EMP1、VEGFC、MMP2蛋白水平: 实验分组同前，根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组细胞的总蛋白， BCA法测定蛋白浓度，上样缓冲液与蛋白体积比为1∶4混合，煮沸5 min。配胶，加样,恒压40 V电泳，待 Marker跑出上层胶后调整电压至80 ～100 V；待 Marker 电泳至距玻板底部1 cm时终止电泳。然后250 mA恒流转印蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，以兔抗人 EMP1、 VEGFC和MMP2抗体作为一抗(1∶500)， 4 ℃孵育过夜， TBST洗膜3 次，10 min/次，再加入羊抗兔二抗(1∶2 000)， 37 ℃ 孵育90 min， 洗膜同前。采用超敏ECL化学发光试剂盒进行显色，实验重复3 次。以EMP1/β-actin、VEGFC/β-actin和MMP2/β-actin的比值作为判断标准。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR- 95在结肠癌细胞中的表达

SW480、HT29、SW620、LOVO和HCT116中SW620的miR- 95表达水平较高(图1)。本研究将采用SW620细胞进行后续实验。

图1 5株结肠癌细胞系中miR- 95的表达结果Fig 1 The exprssion of miR- 95 in 5 colon

2.2 miR- 95干扰慢病毒转染SW620细胞后miR- 95 表达

miR- 95 干扰慢病毒转染结肠癌细胞SW620 72 h后，转染组miR- 95相对表达量明显低于对照组和空载组(P<0.05)(图2,3)。

*P<0.05 compared with control or vector group图2 干扰慢病毒干扰后miR- 95的表达结果Fig 2 The expression of miR- 95 after interferenced

2.3 Transwell 小室检测3组细胞侵袭、迁移能力

转染组细胞侵袭和迁移数均显著低于对照组和空载组 (P<0.05)(图4，5)。24 h后 miR- 95转染组划痕明显宽于阴性对照组和空载组(P<0.05)(图6)。

2.4 MTT法检测转染组、空载组细胞的同种、异种黏附能力

转染组同种细胞间黏附率明显高于异种细胞间黏附率(P<0.05)；转染组同种细胞间黏附率显著高于空载组(P<0.05)；而异种细胞间黏附率显著低于空载组(P<0.05)(表1)。

2.5 Western blot检测3组细胞EMP1,VEGFC 和MMP2的蛋白表达

与对照组、空载组比较，转染组EMP1蛋白表达水平明显增高，VEGFC蛋白和MMP2蛋白表达明显降低(P<0.05)(图7)(表2)。

图3 重组慢病毒转染SW620细胞图

A.control group; B.vector group; C.interference group; *P<0.05 compared with control or vector group

A.control group; B.vector group; C.interference group; *P<0.05 compared with control or vector group

图6 3组细胞划痕实验结果

categoriegroup30min60min90min120minhomogeneouscellvector 016±001 018±004 020±004 021±002interference 033±006∗ 038±004∗# 047±003∗# 050±002∗#heterogeneouscellvector 035±009 056±007 059±009 07±007interference 025±004 028±003▲ 039±003▲ 042±003▲

*P<0.05 compared with homogeneous vector group；#P<0.05 compared with heterogeneous interference group；▲P<0.05 compared with heterogeneous vector group.

图7 各组细胞EMP1，VEGFC和MMP2蛋白表达Fig 7 The proteins expression of EMP1，VEGFC and MMP2 in each group

表2 各组细胞EMP1、VEGFC和MMP2蛋白表达

groupEMP1/β⁃actinVEGFC/β⁃actinMMP2/β⁃actincontrol 0410±0021 0518±0052 0727±0087vector 0432±0028 0519±0022 0698±0062interference 0614±0038∗ 0314±0023∗ 0471±0026∗

*P<0.05 compared with control or vector group.

3 讨论

复发与转移是影响大肠癌患者术后生存率的关键要素，大肠癌转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程，具体机制尚不清楚[7]。研究发现微小 RNA(miRNA)在转录后水平作用于靶mRNA的剪切或翻译，从而参与多种细胞生物学行为，如细胞分化、增殖、侵袭、迁移和凋亡等[8- 9]。miRNA可能是基因调控网络中的关键节点，亦可能是肿瘤治疗的有效新靶点。

目前有研究表明， miR- 95在大肠癌组织中常呈过度表达状态，其能通过SNX1影响结肠癌细胞的增殖[10]。在胰腺癌组织中发现miR- 95高表达，并且抑制 miR- 95的表达能有效抑制胰腺癌细胞的侵袭、迁移；上调miR- 95的表达能有效的促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移[11]。miR- 95与子宫内膜癌的发生、临床分期及淋巴结转移等密切相关，将其作为子宫内膜癌潜在的治疗靶点及预后判断具有重大意义[12]。

在结肠癌细胞系中本研究选取了miR- 95表达较高的SW620细胞系作为研究对象，用干扰慢病毒转染SW620细胞后，通过Transwell小室侵袭、迁移实验和划痕实验发现转染组细胞的侵袭、迁移能力明显比对照组和空载组降低；黏附实验发现转染组细胞的同种黏附能力大于异种黏附能力和空载组细胞同种黏附能力，转染组细胞异种黏附能力小于空载组细胞，以上结果表明miR- 95下调能够抑制结肠癌细胞SW620的侵袭和迁移能力，增加细胞黏附能力。

肿瘤的转移与血管的形成和细胞的黏附能力密切相关。EMP1基因可能是参与细胞信号传导、细胞通信及黏附调节的调节因子之一[13]。口腔鳞癌组织中的EMP1基因表达下调，且其下调与淋巴结转移有关[14]。而目前国内、外关于EMP1与结肠直肠癌发病关系的研究较少， EMP1在大部分结肠直肠癌组织中表达降低，抑制EMP1基因表达后，结肠癌细胞的侵袭、迁移能力增强[5]。本研究结果表明下调miR- 95能够促进EMP1蛋白的表达，抑制VEGFC和MMP2蛋白的表达。

综上所述，抑制miR- 95表达后，结肠癌细胞系SW620迁移和侵袭能力明显下降，细胞黏附能力明显增加，miR- 95能够抑制EMP1蛋白表达，促进VEGFC和MMP2蛋白表达。由此推断miR- 95能够促进结肠癌细胞系SW620侵袭和迁移，很可能是通过调控EMP1、VEGFC和MMP2实现的。因此，miR- 95可能成为结肠直肠癌伴淋巴结转移的分子标志物或新的治疗靶点。

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The effect of miR- 95 on invasion and migration of colon cancer cell line SW620 and potential mechanism

WANG Chao-chao1, XIANG Zheng1*, DU Kun-li1, WANG Chao-yi1, TANG Wei-xue2

(1.Dept.of Gastrointestinal Surgery；2.Research Institute of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective To explore the effect of small molecule noncoding RNA(miRNA- 95) on the invasion and migration of colon cancer SW620 cell line and potential mechanism.Methods The SW620 cells were infected by miR- 95 interference lentivirus.The expression of miR- 95 mRNA was confirmed by quantitative real-time polymerase chain reaction.Transwell chambers, scrath test was conducted to detect the ability of cell invasion,migration among each group;and MTT method was used to detect the intercellular adhesion of homogeneous and heterogeneous cells;Western blot was used to detect the expression of EMP1,VEGFC and MMP2 proteins.Results After infection of SW620 with miR- 95 interference lentivirus for 72 h,significangt fluorescence expression was observed.Compared with empty virus group and ccontrol group,the expression of miR- 95 decreased in transfection group (P<0.05);The invasion and migration were inhibited(P<0.05);the intercellular adhesion of homogeneous cells increased(P<0.05);the intercellular adhesion of heterogenous cells decreased (P<0.05).The expression of EMP1 protein in transfection group was obviously higher,VEGFC,MMP2 protein significangtly lower (P<0.05).ConclusionsmiR- 95 may promote the invasion and migration of SW620 cells,it may be achieved by EMP1,VEGFC,MMP2.

miR- 95；colon cancer；invasive；migration； EMP1

2015- 04- 13

2015- 07- 03

重庆市渝中区科技项目 (20130120)

1001-6325(2015)12-1633-07

R735.3

A

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*通信作者(corresponding author)：xzly@medmail.com.cn