柱层析法连续提取葡萄籽油和多酚的工艺技术

王明阳，李璠，解瑞林，韩寒冰，刘杰凤

（1.茂名出入境检验检疫局，广东茂名525000；2.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名525000）

柱层析法连续提取葡萄籽油和多酚的工艺技术

王明阳1，李璠1，解瑞林1，韩寒冰2，*，刘杰凤2

（1.茂名出入境检验检疫局，广东茂名525000；2.广东石油化工学院环境与生物工程学院，广东茂名525000）

摘要：研究连续提取并分离葡萄籽中的葡萄籽油和多酚的最佳工艺条件。将干燥的葡萄籽粉末用石油醚湿润装进层析柱中，浸泡2h，先后用石油醚和60%乙醇溶液连续洗脱，连续收集石油醚6倍体积（mL/g）和60%乙醇溶液10倍体积洗脱液，混合洗脱液分层，醚层中含有葡萄籽油，下层醇水液中含有多酚。连续提取的葡萄籽油和多酚的提取率均达到99%，经萃取一次性分离葡萄籽油和多酚，得率分别是97.6%和98.0%。利用柱层析连续提取葡萄籽油和多酚，并通过萃取可把两种成分一次性分离开来，工艺简单，时间短，有机溶剂用量少，提取效率高，具有广泛应用价值。

关键词：葡萄籽；柱层析；连续提取；葡萄籽油；多酚

我国每年有近500万t的葡萄用于酿酒，酿酒后产生大量的副产品葡萄籽，一般葡萄的出籽率为8%～10%[1-3]，酿酒后的葡萄籽中含有大量的功能性成分，如葡萄籽油和多酚化合物。葡萄籽含油量为14%～19%，其中不饱和脂肪酸含量高达90%以上，在不饱和脂肪酸中又以亚油酸为主，其含量在58%～78%之间[4]。亚油酸人体必需而又不能合成的脂肪酸。葡萄籽油能降低紫外线的伤害、保护肌肤中的胶原蛋白、改善静脉肿胀与水肿以及预防黑色素沉淀，而且还能调节人体自主神经、营养脑细胞、促进儿童生长发育等，是营养价值很高的保健营养品，宜长期食用，可作为高级食用油及化妆品原料[5]。葡萄籽中含有多种多酚类化合物，主要为儿茶素、槲皮苷、原花青素、单宁等。可将多酚分为色素和无色多酚两大类，色素主要有花色素和黄酮两类，无色多酚主要分为酚酸（苯酸类和苯丙酸类）、聚合多酚（儿茶素和原花色素）及单宁（缩合单宁和水解单宁）等。多酚类物质广泛存在于自然界中，是植物的次生代谢产物，具有清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管疾病、防癌、抗辐射等生物活性功能[6]。

目前，对葡萄籽油和多酚的提取常用溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助萃取法、超临界流体萃取法、加压液相萃取法和酶提取法等[7-9]。但以上方法都普遍存在工艺都比较复杂、提取时间长、溶剂用量大、成本高或分离纯化程序复杂等缺陷。此外，提取只针对性其中的葡萄籽油或多酚化合物，难免造成材料和溶剂的浪费。本研究利用柱层析循环法能同时高效提取和分离葡萄籽油和多酚类化合物，具有溶剂消耗量少、提取效率高、处理时间短和操作简便等优点。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

将酿酒后的广西野生葡萄籽洗净，将其置于50℃的干燥箱中烘干至恒重，粉碎，过40目筛得到葡萄籽粉末，备用。

福林-肖卡试剂（Folin-Ciocalteu）：称取钨酸钠5 g，钼酸钠1.25 g，用水35mL溶于100mL回流瓶中，加入磷酸（H3PO4≥85%）2.5mL及5mL浓盐酸（37%），充分混匀，小火加热回流2 h，再加入硫酸锂7.5 g，蒸馏水2.5mL及数滴溴水后，开口继续沸腾15min，使溴水完全挥发为止，冷却后定容至50 m L，过滤，置于棕色瓶中，用时加入1倍蒸馏水。

7.5%碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠3.75 g溶于25m L温水中，混匀，冷却，稀释至50m L。

1.1.2仪器

玻璃层析柱：广州市东征化玻有限公司；DL-6000低速冷冻大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ5200B超声波清洗器：江苏省昆仑山市超声仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海沪粤明科学仪器有限公司。

1.2葡萄籽油和多酚含量测定

重量法测定葡萄籽油的含量。Folin-Ciocalteau法[10]测定多酚的含量，以没食子酸为对照品，用纯水配成梯度浓度分别为50、100、150、200、250、300μg/mL的多酚标准工作液，在765 nm波长下检测，以没食子酸浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3提取条件

1.3.1葡萄籽油提取条件的确定

称取0.5g葡萄籽粉末6份，分别加入石油醚5mL，室温内摇床振荡（200 r/min），浸泡时间分别为0.5、1、2、3、4、5 h，到时取出，6 000 r/min低温离心10min，分别测定上清液体积，用总体积（5mL）减去上清液体积，计算1 g材料吸收溶剂量（mL），即吸涨率；减压浓缩至恒重后，于电子分析天平上称量，计算得率。确定葡萄籽油在石油醚中溶解达到平衡的浸泡时间。

1.3.2多酚提取条件

将乙醇和水配制成体积分数分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液，称取葡萄籽粉末0.5 g6份分别于10mL提取管中，加入相应浓度的乙醇溶液5mL，室温内摇床振荡（200 r/min）1 h，6 000 r/min低温离心10min，检测多酚的含量。

确定吸涨率和浸泡时间

称取0.5 g葡萄籽粉末6份，分别加入60%乙醇5 m L，室温内摇床振荡（200 r/min），浸泡时间分别为0.5、1、2、3、4、5 h，到时取出，6 000 r/min低温离心10 min，分别测定上清液体积，用总体积（5mL）减去上清液体积，计算1 g材料吸收乙醇溶液量（m L），即吸涨率；测定上清液中多酚含量，确定多酚在乙醇中溶解达到平衡的浸泡时间。

1.4柱层析法提取葡萄籽油和多酚

1.4.1柱层析法[11-14]分别提取葡萄籽油和多酚

选取直径为1.25 cm的玻璃层析柱，准确称取葡萄籽粉末5 g，石油醚湿样上柱，保持石油醚没过样品，室温静置2 h，以吸涨体积（15mL）为一个收集单位（即一份），以每小时收集一份的流速进行收集，共收集3份，残渣经超声1 h，抽滤再得到一份提取液，分别测定各份葡萄籽油的含量。同样方法，用60%乙醇上样，收集3份乙醇提取液和1份残渣提取液（每份25mL），分别测定各份多酚的含量。

1.4.2柱层析连续提取葡萄籽油和多酚

开始阶段与1.4.1项下的方法相同，不同的是收集完两份石油醚洗脱液（共30mL）后，继续收集60%乙醇洗脱液两份（共50mL）。

1.5葡萄籽与多酚的分离

合并1.4.2项下收集的提取液（石油醚30mL，乙醇溶液50mL），分液漏斗萃取，上层醚层含有葡萄籽油，经旋转蒸发减压干燥，重量法测油量；下层醇水液中含多酚，稀释测定其多酚含量。

2　结果与分析

2.1没食子酸标准曲线

图1是没食子酸的标准曲线。

没食子酸含量的回归方程为：y=0.001 6x+0.009 2 （R2=0.9991），说明线性关系良好，线性范围在50μg/mL～350μg/mL之间。

2.2提取工艺条件

乙醇浓度对多酚提取率的影响见图2。

图1　没食子酸标准曲线Fig.1　Standard solution curvesofgallic acid

图2　乙醇浓度对多酚提取效率的影响Fig.2　Affectof ethanol concentration on the extraction rateof polyphenol

从图2可以看出，水的提取率很低，随着乙醇浓度的增大，提取率增大，60%的提取率与80%的提取率接近，纯乙醇的提取率反而降低。因此，选择60%的乙醇溶液作为多酚提取洗脱液。

样品材料对不同溶剂的吸收性能不同，见图3。

图3石油醚和60%乙醇的吸涨率Fig.3　Imbibed rateof petroleum etherand 60%ethanol

从图3可以看出，葡萄籽粉末浸泡1 h后吸收量均达到最大。石油醚和60%乙醇溶液的吸涨率分别接近3倍和5倍（mL/g），因此，石油醚和乙醇溶液分别以3倍体积和5倍体积为1份作一个洗脱液收集单位。

经过不同时间的浸泡，溶液中葡萄籽油或多酚的含量变化见图4。

图4 浸泡时间的测定Fig.4　Determ ination of soaking time

在2 h葡萄籽油和多酚的含量均达到最大，浸泡时间增加，含量也不再增大，说明浸泡2 h后，目标成分在相应的溶剂中已充分溶解达到平衡。因此，可以确定材料在层析柱中浸泡时间为2 h。

2.3分别提取葡萄籽油和多酚的效率

图5是用柱层析法分别提取葡萄籽油和多酚的提取率图。

图5　分别提取葡萄籽油和多酚的提取率Fig.5　Extraction rateofgrapeseed oiland polyphenolby Independent

测定收集的各份葡萄籽油或多酚的含量，以3份提取液和残渣的含量总和看作是目标成分的总含量，结果葡萄籽油和多酚占干重的百分含量分别为16.8% 和6.65%。从图5中可以看出，无论是葡萄籽油或多酚，其第1份和第2份的提取率相加均超过99%，因此在收集洗脱液时，只需要收集第1和第2份就能基本把目标成分提取出来。

2.4连续提取葡萄籽油和多酚的效率

连续收集石油醚提取液30mL和60%乙醇溶液50mL，合并萃取，一次性把两种成分分离开来，分别作定量分析，结果见表1。

表1　连续提取测定葡萄籽油和多酚的含量Table1　Contentof grapeseed oiland polyphenolby sequential extraction

葡萄油的含量16.41%，多酚含量6.51%，得率分别是97.6%和98.0%。

3　讨论

葡萄籽油和多酚的提取常用溶剂萃取法[4]，超声波辅助[4-5]、超临界CO2萃取法[7，15]等，各文献报道的最佳提取工艺条件也差别很大。李瑞丽等[5]对葡萄籽中多酚的超声提取工艺进行了研究，最佳工艺条件为在40℃条件下，以料液比为30∶1的40%乙醇溶液，用120W的超声功率对葡萄籽作用10min。郭雄飞等[6]最佳提取条件是12倍体积60%乙醇超声提取4次，40min/次，提取率可达95%以上。显然，都存在料液比很大，后者还存在提取时间长，次数多等缺点。柱层析法原理是利用混合物中各组分物理化学性质上的不同（如分子大小、形状、极性和分配系数等），使各组分以不同浓度和不同的速度从固体材料中到流动相中，提取液即流动相分子在充满材料的柱体中从上而下流动，洗脱它所流经的材料颗粒，与浸泡提取相比，效率高，溶剂少，提取彻底。并可通过用不同极性的溶剂连续把葡萄籽油和多酚提取出来。

本试验的结果表明，通过柱层析连续提取，3倍体积石油醚和5倍体积的60%乙醇就可把92%以上的葡萄籽油和多酚提取出来，如提取液加倍，提取率就能达到99%以上；而且只需通过简单的萃取即可把两成分分离开来，再通过减压回收石油醚和乙醇，即可得到葡萄籽油和多酚粗产品。因此，柱层析法连续提取既节省大量溶剂，同时也减少后续的浓缩工序，成本低，功能成分损失少，效率高，是一个适合应用到提取分离葡萄籽油和多酚的工艺技术。

参考文献：

[1]高璐,胡博然,祁妤琳,等.葡萄籽油提取工艺研究及对其理化性质的影响[J].食品科学,2009,30(22):81-83

[2]FMATTIVI,U VRHOVSEK,DMASUERO,etal.Differences in the amountand structure of extractable skin and seed tannins amongst red grape varieties[J].Australian Journal of Grape and Wine Research,2009,15(1):27-35

[3]Maier T,Schieber A,Kammerer DR,etal.Residues of grape(Vitis vinifera L.)seed oilproduction asa valuable source ofphenolic antioxidants[J].Food Chemistry,2009,112(3):551-559

[4]赵芙蓉,康健,陈茵茹.响应面试验优化超声波强化复合溶剂提取葡萄籽油工艺[J].食品科学,2013,134(14):40-44

[5]李瑞丽,乔五忠,王艳辉,等.葡萄籽原花青素的超声提取工艺研究[J].食品研究与开发,2006,27(2):64-66

[6]郭雄飞,倪慧,卿德刚,等葡萄籽中多酚类物质的提取和纯化工艺[J].西北农业学报2009,18(4):351-354

[7]赵军.响应面法优化葡萄籽油超临界CO2萃取工艺条件的研究[J].中国酿造,2010(2):135-137

[8]周雯雯,王纯荣,余莉莉.超声波辅助提取葡萄籽油的工艺研究[J].食品研究与开发,2009,30(6):90-92

[9]Haseeb N,John S,GauriS.M.Extraction of polyphenols from grape seedsand concentration by ultrafiltration[J].Separation and Purification Technology,2006,48(2):176-181

[10]Singleton VL,Rossi JA.Colorimetry of total phenlicswith phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J].Am JEnol Vitic,1965, 16(3):144-158

[11]Wang L,Gong LH,Chen CJ,etal.Column chromatographic extraction and separation ofpolyphenols,caffeine and theanine from green tea[J].Food Chem istry,2012,131(8):1539-1545

[12]Zhan PY,Zeng XH,Zhang HM,et al.High-efficient column chromatographic extraction of curcumin from Curcuma longa[J].Food Chemistry,2011,129(2):700-703

[13]韩寒冰,周天,刘杰凤,等.柱层析循环法联合提取脐橙皮中橙皮苷与多糖的工艺研究[J].食品工业科技,2013,34(20):260-264

[14]Han HB,Li H,Hao RL,et al.One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed by automatic separation of volatiles,flavonoids and polysaccharides from Citrus grandis[J]. Food Chemistry,2014,145(2):542-548

[15]张连富,牟德华,杜彦山.超临界流体萃取法提取葡萄籽油工艺的研究[J].中国粮油学报,2007,22(2):60-62,65

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.033

收稿日期：2014-05-28

基金项目：广东省科技计划项目（2013B020503069）

作者简介：王明阳（1977—），男（汉），工程师，本科，研究方向：食品检测与开发。

*通信作者

Sequential Extraction of Oil and Polyphenols from G rape Seed by Colum n Chrom atography M ethod

WANGMing-yang1，LIFan1，XIERui-lin1，HANHan-bing2，*，LIU Jie-feng2
（1.Maoming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Maoming525000，Guangdong，China；2.College ofEnvironmentaland Biological Engineering，Guangdong UniversityofPetrochemicalTechnology，Maoming 525000，Guangdong，China）

Abstract：To explore technical process and conditions for the sequential extraction of grape seed oil and polyphenol by using column chromatography from grape seed.Dried material was loaded into a column with petroleum etherand sequentiallyeluted with 6-fold（mL/g）petroleum ether，10-fold 60%（v/v）ethanol.The eluteswas separated into an ether fraction containing grape seed oil and an ethanol-water fraction containing polyphenol.Through this procedure，grape seed oiland polyphenol in grape seed were simultaneously extracted at99%extraction ratesand simply separated athigher than 97.6%and 98.0%recovery rates.The processwas simple and short，with lessconsumption ofsolventsand high extraction rates.Themethod providesasimpleand high-efficientextraction and separation ofwide rangebioactivesubstances.

Keywords：grape seed；column chromatography；sequentialextraction；grapeseed oil；polyphenol