miR-181b-5p在人卡波西肉瘤组织中的表达变化及临床意义

丁 媛，吴秀娟，康晓静，普雄明

本研究创新点:

国内外现还未有关于miR-181b-5p与卡波西肉瘤发病机制的相关研究。本研究通过研究miR-181b-5p在人卡波西肉瘤组织中的表达变化及其临床意义，为本病的基因诊断及药物靶标提供理论基础，也对miR-181b-5p在卡波西肉瘤中发病机制的深入研究具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为18～25个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA在基因转录后通过与靶mRNA互补结合，抑制mRNA的翻译或降解mRNA，发挥对约30%人类蛋白的表达调节作用。迄今为止，已经发现并命名超过9 500个miRNA，分别参与了细胞的生长、分化和细胞周期调控等多个环节，在胚胎发育、神经生物学、病毒学以及肿瘤学等领域已经有了许多成熟的研究［1］。虽然卡波西肉瘤 (Kaposi's sarcoma，KS)组织来源不清，但大多数研究结果还是认为，KS细胞主要来源于血管内皮细胞和周皮细胞，肿瘤组织中可能还存在某种必要的细胞产物以促进内皮细胞的生长［2］。而有研究表明，miR-181b通过调控核因子κB(NF-κB)信号通路作用于靶基因核蛋白α3［3］，最终参与了血管内皮细胞炎症发生的过程。miR-181b-5p是从miR-181b的前体5'端加工而来。miR-181b-5p是否通过复杂的miRNA调控网络导致血管内皮细胞的异常增殖，最终导致肿瘤的发生，还有待于进一步验证。本研究检测miR-181b-5p在人KS组织中的表达，明确miR-181b-5p是否与KS的发生发展相关。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集2012年1月—2013年10月新疆维吾尔自治区人民医院18例行HE染色且病理检查明确诊断KS患者的KS组织及癌旁组织 (活检取材)，存于液氮罐中。

1.2 主要试剂 miRNeasy Mini Kit试剂盒 (德国Qiagen公司)，Trizol试剂 (美国Invitrogen公司)，RNA酶抑制剂、MMLV反转录酶 (美国Epicentre公司)，10×反转录 (RT)缓冲液、2×PCR Master Mix(美国Super Array公司)，2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合液 (芬兰HyTest Ltd公司)，RT引物 (上海英骏生物技术有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 提取组织总RNA(含miRNA) 取液氮保存的KS组织及癌旁组织 (50 mg)，按miRNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取总RNA。采用紫外线吸收法检测RNA的浓度及纯度，OD260/OD280比值在1.8～2.2之间的用于下一步实验。

1.3.2 RT-RNA 选取 2.5 mmol/L dNTP 混合液 2 μl、10 × RT 缓冲液 2 μl、RT 引物 (1 μmol/L)0.3 μl、总RNA 700 ng、MMLV 反 转 录 酶 (200 U/μl)0.2 μl、RNA 酶抑制剂 (40 U/μl)0.3 μl，加去 RNA 酶水至20 μl，制成RT混合反应液。采用PCR扩增仪进行RT-RNA:16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min，合成的cDNA用于实时荧光定量PCR检测。RT引物:hsa-miR-181b:5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCACCG -3';U6:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测 实时荧光定量PCR检测使用ViiA 7 Real-time PCR系统，实时荧光定量PCR反应体系:2 × PCR Master Mix 5 μl、10 μmol/L PCR 特异引物:上游引物 0.5 μl、下游引物 0.5 μl，加水至总体积为8 μl，轻弹管底将溶液混合，以5 000 r/min离心1 min(离心半径10 cm)。将8 μl混合液加到384孔PCR板对应孔中，再加入对应的cDNA 2 μl，小心粘上Sealing Film封口膜，并以5 000 r/min离心1 min(离心半径10 cm)。U6和各样品的目的miRNA均按以下程序进行:95℃ 10 min，共40个 PCR循环〔95℃ 10 s，60℃ 60 s(收集荧光)〕。扩增反应结束后，95℃ 10 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行，升温速率为0.05℃/s)，建立PCR产物的熔解曲线。得到基本循环数 (Ct)值，以U6为内参，△Ct=Ct与内参循环数差值，△△Ct=最低样本△Ct值 -其他各样本△Ct值，目的基因相对含量=2-△△Ct。hsa-miR-181b-5p PCR 特异引物的上游引物为:5'-GGGAACATTCATTGCTG-3'，下游引物为:5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'。U6 PCR特异引物的上游引物为:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物为:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.4 分类标准 KS组织病理分期［4］:(1)斑片期:无增生的梭形细胞和血管成分，真皮内血管增生扩张，倾向于形成新生血管，非特异性改变;(2)斑块期:少量血管成分，梭形细胞逐渐增多;(3)结节期:梭形细胞明显密集。全身皮损类型［5］:斑片、斑块、结节、糜烂、水肿。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以 (±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 患者均为维吾尔族，其中男17例，女1例;年龄29～79岁，平均 (60.0±14.1)岁;病程1～132个月，平均 (24.2±33.8)个月;KS组织病理分期:斑片期5例，斑块期5例，结节期8例;全身皮损面积:≤1%6例，＞1%12例;全身皮损类型≤2种7例，＞2种11例;人疱疹病毒8型 (HHV-8)阳性15例，阴性3例;人类免疫缺陷病毒 (HIV)阳性7例，阴性11例;HIV合并HHV-8双阳性6例，双阴性2例。

2.2 KS组织和癌旁组织中miR-181b-5p表达水平KS组织中miR-181b-5p表达水平为 (0.73 ±0.40)，癌旁组织中miR-181b-5p表达水平为 (0.24±0.16)，差异有统计学意义 (t=4.826，P＜0.01)。

2.3 miR-181b-5p表达水平的单因素分析 不同年龄、病程、全身皮损面积、全身皮损类型及HHV-8、HIV阴阳性患者KS组织中miR-181b-5p表达水平比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。不同肿瘤组织病理分期患者KS组织中miR-181b-5p表达水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);斑块期、结节期患者miR-181b-5p表达水平高于斑片期，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。HIV合并HHV-8双阳性患者miR-181b-5p表达水平为 (0.32 ±0.19)，HIV 合并HHV-8双阴性患者miR-181b-5p表达水平为 (0.43±0.17)，差异无统计学意义 (t=1.615，P=0.158)。

3 讨论

由于获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)合并KS病死率高，且KS可以帮助早期诊断AIDS以及评估预后［6］，故其在AIDS的防治工作中发挥着巨大作用。现已证明，miR-181b在炎症和恶性肿瘤中形成并建立了广泛的联系，miR-181b上游被STAT3和HMGA1转录因子所调节，其中STAT3通过白介素6(IL-6)激活的转录因子直接激活miR-181b，从而抑制肿瘤抑制基因PTEN和CYLD的功能，导致NF-κB活性增强后造成炎症的发生，而miR-181b通过抑制下游靶基因CBX7参与调控细胞周期，通过P27、BCL2等靶基因影响肿瘤细胞增殖、细胞黏附和凋亡［7］;近年研究发现，miR-181b在肿瘤的发生和发展中发挥十分重要的作用［8］。研究显示，miR-181b表达水平在结肠癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、肝细胞癌、乳腺癌、甲状腺癌、口腔癌、骨肉瘤、急性髓细胞性白血病、成视网膜细胞瘤中上调，在神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、胃癌、肺癌、前列腺癌中下调［8］，以上结果均提示miR-181b的功能较为独特，其表达水平上调或下调取决于肿瘤的类型和与之对立的细胞种类;miR-181b还参与了各种肿瘤细胞的生物学活动［8］。国内、外少见KS与人miRNA的报道，本研究通过实时荧光定量PCR检测KS组织中miR-181b-5p的 表 达 水 平，结 果 显 示，miR-181b-5p在KS组织中的表达水平高于癌旁组织，表明其与KS的发生发展可能存在着密切关系，提示miR-181b-5p对于KS来说可能是一种致瘤基因。

表1 miRNA-181b-5p表达的影响因素分析 (±s)Table 1 The influence factors of miRNA-181b-5p expression

表1 miRNA-181b-5p表达的影响因素分析 (±s)Table 1 The influence factors of miRNA-181b-5p expression

注:*为F值;与斑片期比较，△P＜0.05;HHV-8=人疱疹病毒8型，HIV=人类免疫缺陷病毒

因素 例数 miRNA-181b-5p表达水平 t(F)值 P值年龄(岁)11 0.83 ±0.40 1.739 0.101≥60 10 0.59 ±0.39＜60 8 0.91 ±0.37病程(月) 0.816 0.427≤6 6 0.84 ±0.44＞6 12 0.68 ±0.39肿瘤组织病理分期 4.181* 0.036斑片期 5 0.37 ±0.22斑块期 5 0.96 ±0.40△结节期 8 0.82 ±0.37△全身皮损面积(%) 0.504 0.621≤1 6 0.80 ±0.42＞1 12 0.70 ±0.41全身皮损类型(种) 0.425 0.677≤2 7 0.78 ±0.43＞2 11 0.70 ±0.41 HHV-8 1.392 0.183阳性 15 0.41 ±0.11阴性 3 0.25 ±0.14 HIV 0.834 0.416阳性 7 0.67 ±0.41阴性

本研究结果显示，不同年龄、病程、全身皮损面积、全身皮损类型及HHV-8、HIV阴阳性患者KS组织中miR-181b-5p表达水平无差异。有研究报道，HHV-8和HIV双重感染可增加KS的发生率，双重感染患者病死率较单纯感染患者明显提高［9］，提示双重感染患者病情可能较重，miRNA-181b-5p在肿瘤组织中高表达。而本研究结果显示，HIV合并HHV-8双阳性患者miR-181b-5p表达水平与HIV合并HHV-8双阴性患者无差异，可能和本研究临床病例数较少有关。

Lu等［10］认为，miRNA表达谱可以作为肿瘤组织分型的依据，还可以作为细胞分化程度的客观评价，从而得出miRNA可能参与了细胞分化状态的结论。通过对肿瘤组织和正常组织间细胞分化程度的对比，建立与之对应的肿瘤miRNA标签或miRNA表达谱，对于肿瘤的早期诊断和靶向治疗有积极推动作用。Heffelfinger等［11］发现，通过miRNA的表达水平可以对8例浸润型基底细胞癌患者中的7例进行准确分类，没有准确分型的1例患者为混合型基底细胞癌。尤其是miR-183的表达水平在浸润型基底细胞癌中明显低于结节型基底细胞癌，进一步证明其可抑制肿瘤的浸润和转移。Santucci等［12］认为，KS和其他皮肤肿瘤 (如蕈样肉芽肿)一样，分为斑片期、斑块期和结节期，临床上表现为一个连续发展的过程。在组织学上亦是如此，斑片期组织学以非特异性炎症为主，而斑块期和结节期则以增生的梭形细胞和血管瘤样结构表现为主。本研究中，虽然斑块期、结节期患者KS组织miR-181b-5p表达水平均高于斑片期，提示miR-181b-5p可能促进肿瘤的生长;但结节期与斑块期无差异，考虑和本研究病例数较少有关，也可能与miRNA-181b-5p不能完全体现KS谱性改变有关，故需要进一步增加病例数后验证。

KS发病率相对较低，故本研究纳入病例数较少，而且研究较为局限，未进行相关细胞学功能以及靶基因的深入研究，本研究组将继续扩大样本量进一步验证其是否可以完全体现KS的谱性改变，并进行靶基因预测，进而验证其靶基因的功能，从而为临床的诊断提供帮助，为探索KS特异性诊断和治疗的新方法提供理论依据。

综上所述，miRNA-181b-5p在KS组织中的表达水平明显上调，且在斑片期损害中相对表达水平较低，表明其与KS的发生发展存在着密切关系，miRNA-181b-5p有可能成为潜在的分子诊断及治疗指标之一。

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