8周有氧运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响

张颖++梁美杨

摘要：通过探讨8周的有氧运动对雌性大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响，探究体育锻炼是否通过改善细胞凋亡的能力从而延缓了细胞衰老。按照月龄将大鼠分为青年组、中年组、老年组，每个年龄又分为运动组和对照组。运动组大鼠每日进行1h的跑台运动，对照组常规饲养。8周后，处理动物，取大鼠骨骼肌，通过免疫组化技术，定量分析大鼠骨骼肌BCL-2、BAX的含量。结论发现：所有大鼠骨骼肌中均存在细胞凋亡现象。随着年龄增长，老年组大鼠骨骼肌细胞凋亡呈明显上升趋势（P<0.01）。有氧运动对青年组大鼠骨骼肌细胞凋亡有促进作用（P<0.05），老年运动组大鼠骨骼肌细胞凋亡则有下降的趋势（P>0.05）。年龄和有氧运动的交互作用证明：8周有氧运动对促进青年组大鼠骨骼肌新陈代谢、延缓老年组大鼠肌细胞萎缩有积极作用。

关键词：有氧运动；大鼠；骨骼肌；细胞凋亡

中图分类号：G804 文献标识码：A 文章编号：1008-2808（2015） 02-0087-05

Abstract：Through an investigation of 8 weeks aerobic exercise influence on female rat skele-tal muscle cell apoptosis. To explore whether the physical exercise by improving the ability ofthe cell apoptosis and delayed the senescence of cells. methods According to months rats di-vided into young， middle - aged and elderly group. Every age is divided into exercise groupand control group. Exercise group rats run daily for l hour's motion， the control group con-ventional breeding. After eight weeks， handle animal， in rat skeletal muscle， using immuno-histochemical techniques， quantitative analysis of rat skeletal muscle the BCL-2， BAXlevels. Conclusion all the rat skeletal muscle apoptosis phenomenon exists. As we age， eld-erly group rats skeletal muscle apoptosis showed a trend of increased obviously （P<0.01）.Aerobic exercise for youth promote skeletal muscle cells apoptosis in rats （P<0.05）， theolder group rats skeletal muscle apoptosis is the trend of decline （P>0.05 ） . Age and the in-teraction of the aerobic exercise to prove： 8 weeks aerobic exercise to promote young rat skel-etal muscle metabolism， delay the elderly group muscle atrophy in rats have a positive effect.

Key words：Aerobic exercise ； Rats ； Skeletal muscle ； Cell apoptosis ；

有氧运动是由Kennth H.Cooper博士于1968年倡导的，顾名思义就是在有氧代谢状态下做运动，在运动过程中，人体吸人的氧气与需求相等，达到生理上的平衡状态。作为运动人体科学领域的研究重点，科研人员在诸多领域对有氧运动进行了深入的研究，也取得了长足的进展。细胞凋亡是指在生命体发育、生长、衰老过程中，为了维持内环境稳定而对不同有害刺量的应答，或在疾病中所产生的一种特殊的，受核DNA控制的细胞自杀行为。由此可见细胞凋亡是一种主动的、由遗传控制的程序性现象，故也称为细胞程序化死亡。细胞凋亡是受基因控制的。根据所起作用可将参与调控细胞凋亡的基因分为促进凋亡基因和抑制凋亡基因。BCL-2就是抑制细胞凋亡的典型基因，而BAX则属于促进凋亡亚族的一员。

运动与骨骼肌密切相关。人体的各种运动都是在骨骼肌的收缩下完成的。因此对于骨骼肌的研究一直是运动人体科学领域的重点。但通过查阅资料发现：对于骨骼肌的研究多集中在生理生化领域，针对骨骼肌细胞凋亡的研究文献较少。因此，本文通过实验，阐述有氧运动对增龄SD大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响。

1 实验对象与方法

1.1 实验对象及分组

不同月龄雌性SD大鼠60只，购白黑龙江中医药大学动物安全评价中心，标准啮齿类动物饲料喂养。饮食饮水自由，动物房内温度18℃～ 25℃，相对湿度40%～50%。白然光照，保证动物房安静，整洁，通风。每天上午填食、加水、换垫料。按照月龄将SD大鼠分为青年组（3个月左右）20只，（6个月左右）20只，老年组（13个月左右）20只。将每组大鼠随机抽取10只作为实验组，10只作为对照组。实验组和对照组体重、体质均无显著性差异。

1.2 实验方案

实验组大鼠适应性饲养一周，然后进行适应性跑台训练20min。第二天进行筛选：跑台坡度0°，速度15m/min，运动60min。凡不能完成或完成但出现异常表现者（如运动不协调、长时间趴在跑台带上、有明显伤口及出血者）淘汰。接下来参照T.G.Bedford等方法，采用中等强度运动训练。跑台坡度00，lh/次，1次/日，每周6次，休息1天，共8周。跑速逐渐递增。开始速度为10 m/min，lOmin后速度增加至11 m/min。以此类推，每个速度均跑10min，最后调整至15m/min。不能完成测试者淘汰。选材时没有大鼠被淘汰。对照组常规饲养。endprint

1.3 动物取材及细胞凋亡的检测

1. 3.1 动物取材 各组大鼠在8周实验结束后进行取材，取材前一天禁食。配制10%的水合氯醛溶液作为麻醉剂。麻醉剂量根据体重决定，每千克注射350ml水合氯醛。麻醉后，把大鼠固定在手术台上，剪开下肢皮肤，取腓肠肌作为实验样本。在生理盐水中冲洗后，保存至福尔马林溶液中。

1.3.2 制作蜡块 将泡在福尔马林中的腓肠肌横切，厚度约3mm左右。切好的肌肉置于模具中，用自来水冲洗th。然后脱水：70%乙醇1 h→80%乙醇Ⅰh→90%乙醇过夜→100%乙醇Ⅰ1h→100%乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min。

骨骼肌脱水后浸蜡，在70℃的温箱中，将组织分别放在液体腊（一）1.5 h→液体蜡（二）1.Sh→液体蜡（三）1h。

将溶化好的纯腊倒在制蜡块的模具中，把浸好蜡的肌肉组织放入其中，室温条件下过夜。第二天蜡块即可制成。蜡块修理后用YD-1508B轮转式切片机把蜡块切成7μm的蜡片。在温水浴中展片、用载玻片捞片、用DHP-9162型电热恒温培养箱把片子烘干。石蜡切片即制作完成。

1. 3.3 细胞内基因蛋白表达的检测 通过试剂和抗体来检测大鼠腓肠肌组织内bcl-2和bax的基因蛋白表达。试剂盒购白武汉博士德公司。抗体为PV6001（山羊抗或兔1gG抗体-HRP多聚体）。主要步骤如下：

（1）脱蜡、水化组织切片：二甲苯15min→二甲苯Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ5min→100 %乙醇Ⅱ5min→90%乙醇5min→80%乙醇Smi0→70%乙醇5min→水5min→PBS冲洗2次，每次5min→抗原修复→室温下晾凉。

注：PBS浓度为0.02mol/L，PH值7.2～7.6。具体配置方法：精确称取并在烧瓶中依次加入Nac19g，Na2HP04 12H206g，NaH2P04 2H2O 0.4g，加蒸馏水1000ml，PBS液即配制而成。

注：抗原修复所用柠檬酸盐缓冲液浓度为0.01 mol/L，PH=6.0。具体配制方法：C6H5Na3072H2O（柠檬酸三钠）3g，C6H8O7 H2O（柠檬酸）0.4g，加蒸馏水1000ml配制而成。柠檬酸盐缓冲液的优点是染色背景清晰，适用于绝大多数抗体。抗原修复即把载玻片架置于柠檬酸溶液中，用微波炉加热4min。加热过程中试剂不可太少，因为微波炉温度太高，液体蒸发过快。试剂也不可太多，有溢出的危险。加热时给容器加盖，但需要留出一条缝。

（2）把载玻片置于3%过氧化氢中孵育10min，用PBS冲洗3次，每次2min。

（3）封闭：在组织上滴加羊抗血清封闭，20min后甩去。

（4）滴加一抗，37℃孵育1.5h，或者4℃过夜。然后用PBS冲洗3次，每次2min。（通过预实验确定一抗的浓度为1：75）

（5）按照一抗的来源，分别加相应的检测试剂PV6001（山羊抗或兔IgG抗体-HRP多聚体）。在室温或者37℃温箱里孵育30min后，用PBS冲洗3次，每次2min。

（6）显色：滴加DAB显色剂，5min左右即可。当观察到组织变成棕色即可判定为阳性细胞。可以终止反应。

（7）用蒸馏水充分冲洗2次，每次2min。加蒸馏水即阻断了反应。

（8）复染、脱水、透明：苏木素2min→自来水→蒸馏水3min→80%乙醇3min→90%乙醇3min→100%乙醇Ⅰ3min→l00%乙醇Ⅱ3min→二甲苯Ⅰ3min→二甲苯Ⅱ3min

（9）封片：用中性树脂胶滴在载玻片的组织旁，再用盖玻片盖上。

（10）观察：用光学显微镜观察片子，统计后进行定量分析。

1. 3.4 免疫组化染色统计 Bcl-2、bax的免疫反应产物的标记强度用平均值A来表示。把每组制作的8张骨骼肌组织切片在40×10的放大倍数下选取3个视野拍照。使用LEICA Q550W图像分析系统对照片进行分析。从而测定出bcl-2、bax的A值。调节系统去除本底后测量特异染色的平均光密度值。用测得的bcl-2、bax蛋白的A值减去背景A值即得到校正A值（CA值）。CA值即为凋亡蛋白免疫反应的实际A值。用CA值进行分析可以避免染色过程中非特异染色所造成的误差。

1.4 数据处理与统计

本实验的数据用SPSS19.0软件包进行处理，所有数据均采用平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行显著性差异分析。P<0.05即表示有显著性差异，P<0.01，为差异非常显著。

2 结果与分析

2.1 实验结果

从表1可以看出青年对照组和青年运动组大鼠的骨骼肌中bcl-2的表达无显著性差异（P>0.05）。中年组的值整体上虽然略低于青年组，但在中年对照组和中年实验组织间也没有体现出明显差异。老年运动组bcl-2蛋白表达显著低于老年对照组（P<0.05）。增龄因素对骨骼肌bcl-2的表达影响非常显著，不同年龄段对照组大鼠比较P<0.01。各年龄段运动组大鼠之间bcl-2有显著性差异（P<0.05）。

通过表2可知：各年龄段大鼠bax的表达结果组间比较均无显著性差异（P>0.05）。对照组大鼠之间差异显著（P<0.05）。但bax的CA值没有与年龄呈现线性关系。

青年组促凋亡蛋白因子的表达高于中年组。老年对照组bax显著高于中青年组。在运动和年龄的双重因素干预下，各组织间bax的表达有显著性差异（P<0.05）。运动组大鼠bax值与年龄呈现出线性关系。即随着年龄的增长，运动组大鼠bax的表达逐渐明显。

2.2 分析与讨论

目前的研究普遍认为，细胞凋亡是一个“瀑布式”基因表达过程，根据所起的作用将参与调控细胞凋亡的基因分为促凋亡基因和抑制凋亡基因。以bcl-2为代表的抑制凋亡的因子和以bax为代表的促进调往因子共同决定了大鼠骨骼肌细胞凋亡情况。白20世纪80年代中期起，对细胞凋亡的研究日益蓬勃发展起来，所涉及的领域也越来越广泛。2002年，诺贝尔医学与生理学奖授予了在细胞凋亡的研究中有卓越贡献的三位科学家。此后的10余年，诸多研究人员对细胞凋亡现象进行了全面的研究探索，并取得了一定的进展。但对运动刺激引起细胞凋亡现象的研究还比较滞后。特别是运动对骨骼肌细胞凋亡的研究更是不多见。endprint

本实验通过对不同年龄的对照组和运动组大鼠细胞凋亡相关蛋白进行检测，来研究运动、年龄两个因素与骨骼肌细胞凋亡的关系。机体的各种运动都是依靠骨骼肌的收缩来完成的。骨骼肌是体内含量最多的组织，约占体重的40%左右。哺乳动物的骨骼肌会随着衰老而发生萎缩。细胞死亡的阻抑基因和启动基因彼此相互作用，最终结果依赖于死亡因子与死亡抑制因子的比值。长时间中等强度的有氧运动对骨骼肌细胞凋亡的影响，国内外的研究基本都是针对废用性肌萎缩、肌营养不良和肌肉失重等肌纤维损伤的情况而开展的。有研究证明：骨骼肌细胞凋亡是肌营养不良症、肌废用性萎缩以及心力衰竭病人运动耐受力下降的原因。但通过进行长期有氧运动训练，可以明显的减弱细胞凋亡的能力，从而延缓由于细胞凋亡增多而导致的废用性肌萎缩。

如表1所示，各年龄段大鼠骨骼肌bcl-2的表达结果有显著性差异。说明年龄对于大鼠肌细胞发生细胞凋亡有着至关重要的影响。对照组之间差异非常显著（P<0.01），随着年龄增长bcl-2的表达逐渐减弱。表2的对照组数据也表明：老年大鼠骨骼肌bax的表达显著高于青年、中年组大鼠。说明年龄越大，肌细胞凋亡蛋白的表达越多。这可以解释衰老的大鼠骨骼肌萎缩老化、肌纤维减少等现象。关于增龄骨骼肌萎缩与细胞凋亡的关系，国内外的报道并不多见。Amie Dirks等对大鼠进行实验，经研究发现，老年大鼠腓肠肌细胞凋亡率比青年大鼠提高50%左右。这与本实验的研究结果一致。在运动组中，bcl-2因子的表达在不同年龄段大鼠也有显著性差异（P<0.05），但没有对照组变化明显。Bax的表达随年龄增加而增加。且形成了显著性差异（P<0.05）。这说明随着年龄的增涨，老年大鼠细胞凋亡加速。但是运动可以让老年大鼠细胞凋亡相关因子的表达可以延缓。

年龄的增涨促进骨骼肌细胞凋亡这一规律在青年、中年大鼠中并不适用。通过表1和表2的数据，可以看到青年、中年组大鼠骨骼肌细胞凋亡因子的表达无显著性差异。促凋亡因子bax在青年对照组的表达高于中年对照组。这可能是由于青年组大鼠处于生长发育期，新陈代谢活跃。促凋亡蛋白的活跃表达加快了青年组大鼠肌细胞的更新速率，适应了青年组大鼠骨骼肌在增龄过程中的功能需求。而中年组大鼠骨骼肌的生长趋于稳定，因此促凋亡因子的表达低于青年组，这也说明长期有氧运动促进了青年大鼠肌细胞凋亡的发生和发展。从一个侧面反应了中年大鼠的新陈代谢低于青年大鼠。本文推测，青年大鼠正处于生命旺盛、活动力极强的阶段，长期有氧运动促进青年大鼠肌细胞发生凋亡，使那些衰老退化、功能低下的细胞迅速清除出去；肌细胞凋亡率的增加同时引发卫星细胞进入肌细胞中，产生新的肌原纤维并对损伤的肌纤维进行修复。

总之，有氧运动加快了青年大鼠肌细胞的更新速率，使那些不能适应机体运动需要的细胞在竞争中选择了凋亡的形式来结束生命，而那些强健的细胞则保留，满足青年大鼠肌肉强健的生理需要。通过运动干预，发现青年运动组、中年运动组大鼠骨骼肌促凋亡因子更加活跃，均高于同年龄段的对照组大鼠。提示有氧运动加快了青年和中年大鼠骨骼肌新陈代谢。细胞凋亡是生物体细胞死亡的一种独特方式，在骨骼肌生长发育过程中，细胞凋亡对肌细胞的数量、质量均起到重要的调节作用。对于长期有氧运动对于肌细胞的影响，李爽通过实验得出结论：长期有氧运动可以明显诱导青年组大鼠骨骼肌发生细胞凋亡，从而加快了肌细胞的更新速率。运动可以明显抑制老年组大鼠细胞凋亡的发生和发展，从而延缓了由于白然增龄引发的肌纤维萎缩等现象的发生。这与本文实验结果基本一致。

3 结论

本实验各组大鼠骨骼肌均存在细胞凋亡现象。老年组大鼠骨骼肌细胞凋亡现象最为明显。这可能是导致肌肉萎缩、肌细胞减少等衰老现象出现的原因之一。青年组大鼠骨骼肌细胞凋亡情况比中年组大鼠明显，这可能是青年组大鼠新陈代谢旺盛所导致的。

年龄和有氧运动的交互结果证明，中等强度的有氧运动可以促进中青年雌性大鼠骨骼肌细胞凋亡的发生，使机体肌肉保持在较高的新陈代谢水平上。同时可以有效延缓增龄导致的细胞凋亡率上升，从而延缓骨骼肌萎缩的趋势。

本实验采用的大鼠均是自然增龄的样本，因此实验结果对于人也有借鉴意义。基于实验结论，建议各年龄段的人均可以采取中等强度有氧运动的方式来进行强身健体。特别是老年人，适当的运动能够增强肌肉功能，提高肌肉能力。

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