miRNA-145抑制肺癌A549细胞增殖活性的机制

王丹

（第二军医大学基础部神经生物学教研室，上海200433）

miRNA-145抑制肺癌A549细胞增殖活性的机制

王丹

（第二军医大学基础部神经生物学教研室，上海200433）

目的：研究miRNA-145（miR-145）抑制肺癌A549细胞增殖活性的机制。方法：应用生物信息学方法预测Sp1基因3′-UTR区与miR-145的结合位点并通过荧光素酶报告基因法进行验证；转染miRNA-145拟似物和阻遏物到A549细胞，实时荧光定量PCR法检测细胞内miR-145含量，蛋白质印迹法检测细胞中Sp1蛋白含量；同时采用MTT法检测转染后24，48和72 h A549细胞的增殖活性。结果：荧光素酶报告基因系统验证结果表明，成功预测了miR-145与人Sp1基因3′-UTR区的结合位点。与单独转染组比较，miR-145拟似物和miR-145阻遏物与野生型荧光素酶报告基因共转染可以明显抑制或增强荧光素酶活性（P＜0.05）。转染miR-145拟似物和阻遏物能明显抑制或者促进A549细胞内Sp1蛋白的表达（P均＜0.05）。实时荧光定量检测结果表明，转染后48 h，与转染对照组比较，拟似物组细胞内miR-145含量明显上升，而阻遏组细胞内miR-145含量明显下降（P均＜0.05），阴性对照转染组和转染对照组miR-145相对含量间的差异无统计学意义（P＞0.05）。细胞活性检测结果表明，转染72 h后，拟似物组细胞增殖活性明显降低，而阻遏组细胞活性明显增高（P均＜0.05）。结论miR-145通过抑制Sp1基因表达，明显抑制A549细胞的增殖活性。

转录因子Sp1；A549细胞；miR-145；增殖活性

我国每年新发肺癌约70万例，对74个城市肺癌抽样调查显示，肺癌死亡率占各种恶性肿瘤死亡率的首位［1-2］。因此，寻找潜在的基因靶点和新的治疗手段，已成为肺癌治疗中迫切需要解决的问题。Sp1基因编码相对分子质量为105 000的蛋白质，当Sp1蛋白中的激活区与被调控基因启动子区域的DNA结合后，可以影响基因转录活性［3］。Sp1与肿瘤发生、发展密切相关，在多种肿瘤，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌和甲状腺肿瘤中都有高表达［4-5］。多项研究指出，在同一患者体内，肿瘤组织中的Sp1蛋白表达水平明显高于癌旁组织，且与肿瘤侵袭、转移密切相关［6-7］。Sp1在不同类型肿瘤中异常表达的原因不尽相同，而呈现多样性。

据报道，Sp1蛋白在肺癌中高表达［8］，而微小RNA（microRNA，miRNAs）则可通过调控Sp1蛋白影响肿瘤的发生和发展［9-10］。我们使用生物信息学软件预测Sp1基因3′-UTR区可能存在理论靶位的miRNAs，发现存在miR-145理论结合位点。我们据此推测，肺癌细胞内Sp1基因高表达可能与miR-145的低表达相关，如果miR-145与Sp1基因具有靶位关系，很可能肺癌细胞中miR-145的低表达会减弱其对Sp1基因的调控作用，这也有可能是肿瘤细胞中Sp1蛋白高表达的原因之一。本实验拟通过生物信息学软件预测has-miR-145与人Sp1之间可能存在的靶位关系，并通过荧光素酶报告基因系统进行验证；在A549细胞内干预miR-145，观察Sp1蛋白表达以及细胞增殖能力的变化，进而明确miR-145在肺癌调控中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人肺癌A549细胞和293细胞均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM高糖细胞培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂盒（Trizol）及反转录试剂盒（M-MLV）均为美国Invitrogen公司产品，荧光素酶报告基因表达载体（pGL3-Promoter）和荧光素酶检测系统（Promega公司），Sp1蛋白一抗及二抗均为美国Abcam公司产品，细胞总蛋白提取及定量试剂盒、化学发光试剂盒均为美国Thermo公司产品，miRNA合成、测序均由Invitrogen公司进行，MTT和DMSO为Sigma公司产品。

1.2 仪器和设备

细胞培养箱为美国Thermo公司产品，水平离心机、高速低温离心机以及微量移液器为Eppendorf公司产品，电泳仪、垂直电泳槽及转膜仪购于上海天能公司，酶标仪及紫外分光光度检测仪为Thermo公司产品，PCR仪为TaKaRa公司产品。

1.3 方法

1.3.1 miR-145靶基因预测 采用TargetScan预测软件对Sp1（NM_003109）3′-UTR区进行结构预测，分析是否存在miR-145的结合位点。预测结果显示（图1），hsa-miR-145在Sp1的3′-UTR区存在6个碱基的种子区。

图1 hsa-m iR-145与Sp1的靶位关系预测

1.3.2 has-miR-145与Sp1预测靶位关系的验证

1.3.2.1 荧光素酶报告基因表达载体的构建 取对数生长期293细胞，Trizol裂解法提取细胞总RNA，反转录制备cDNA。针对Sp1基因3′-UTR区设计PCR引物：上游引物，5′-GCTCTAGATTGTATATCCTATATAGG-3′，下游引物，5′-GCTCTAGAAAGCATAACAGGGGCCTGATT-3′，引物两端分别添加XbaⅠ酶切位点，PCR扩增包含miR-145靶位5′-ACTGGA-3′在内的219 bp的碱基序列。取2μL cDNA为模板，使用上面引物进行PCR扩增，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环数为38个。扩增后使用XbaⅠ对PCR产物进行酶切处理，酶切回收目的片段后克隆至pGL3-Promoter荧光素酶报告基因表达载体，重组载体经序列分析后命名为pGL3-Pro-WT-Sp1。以pGL3-Pro-WT-Sp1为基础，对miR-145靶位进行点突变，即将5′-ACTGGAA-3′突变为5′-TGAACAG-3′，构建突变型荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Pro-MT-Sp1。对两组荧光素酶报告基因表达载体进行无内毒素质粒DNA提取。同时，化学法合成miR-145拟似物，miR-145阻遏物和miR-145阴性对照。

1.3.2.2 细胞转染及荧光素酶活性检测 选取生长状况良好且处于对数生长期的第3代293细胞，用胰酶消化并制备细胞悬液，台酚蓝染色后使用血细胞计数板进行活细胞计数，使用完全培养基（DMEM+10%FBS）调整细胞密度为1×105个/mL，将细胞接种到6孔板，每孔加2 mL细胞悬液，37℃和5%CO2条件下培养24 h，参照Lipofectmaine 2000转染试剂说明书进行质粒和RNA共转染。转染分为9组：293细胞对照组，293细胞+pGL3-WT组，293细胞+pGL3-MT组，293细胞+NC+pGL3-WT组，293细胞+NC+pGL3-MT组，293细胞+ miR-145拟似物+pGL3-WT组，293细胞+miR-145拟似物+pGL3-MT组，293细胞+miR-145阻遏物+pGL3-WT组，293细胞+miR-145阻遏物+pGL3-MT组。同时每组细胞转染100 ng的海肾荧光素酶（pGL-TK）作为荧光霉素活性的检测参照。转染后48 h，使用Promega公司的双荧光素酶检测系统和荧光素酶检测仪检测荧光素酶含量。

1.3.3 转染miR-145对肺癌A549细胞株胞内Sp1蛋白表达的影响

1.3.3.1 细胞转染 取对数生长期的A549细胞，胰酶消化后1 000×g离心2 min收集细胞，用含10%FBS的DMEM重悬细胞，调整细胞密度至1× 105个/mL，接种细胞到6孔细胞培养板，每孔添加2 mL细胞悬液，37℃和5%CO2条件下培养24 h。转染过程按照Lipofectmaine 2000说明书进行。实验分为4组，即转染对照组（只加转染试剂），阴性对照（negative-control，NC）序列转染组，miR-145拟似物转染组（拟似组）和miR-145阻遏物转染组（阻遏组）。

1.3.3.2 蛋白质印迹法检测Sp1的表达量 转染后48 h，去掉细胞培养基，每孔加入1 mL无菌PBS洗细胞2遍，加入0.5 mL细胞裂解液，按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白，BCA法定量细胞总蛋白浓度。定量后的细胞总蛋白以每组10μL进行垂直电泳，SDS-PAGE分离胶浓度为10%，110 V电泳90 min后，立春红染色观察蛋白条带是否完整，400 mA转膜90 min，转膜后以5%脱脂牛奶封闭2 h，4℃一抗孵育过夜，Sp1和GAPDH一抗稀释（TBST）比分别为1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀释比为1∶4 000；TBST洗膜3次，添加化学发光液反应底物，暗室曝光，扫描曝光底片，统计目的条带光密度值（D值）。D值目的蛋白/D值GAPDH，即为Sp1蛋白的相对含量。

1.3.3 A549细胞增殖活性的检测 转染后48 h，胰酶消化法制备A549细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10%FBS的DMEM完全培养基调整细胞密度至1×105个/mL，接种细胞到96孔细胞培养板，每孔添加100μL细胞悬液，轻晃培养板使其分布均匀，37℃和5%CO2条件下培养细胞，并于接种后的24，48和72 h，采用MTT法检测细胞活性。检测前，每孔细胞加入5mg/mLMTT溶液10μL，轻晃使其分布均匀，继续培养4 h，去上清，每孔加入150μL DMSO溶液，37℃孵育15 min，酶标仪检测570 nm波长细胞液的D值，根据D值制作细胞对数期生长曲线。

1.3.4 转染后细胞内miR-145含量检测 细胞样本获取的时间点与MTT检测时间点一致，细胞培养使用6孔板，接种密度为2×105个/孔。细胞收集前，每孔使用4℃预冷的无菌PBS洗去细胞表面残留的培养液及血清；去掉PBS，每孔加入1 mL 4℃预冷的Trizol细胞裂解液，震荡培养板充分裂解细胞，4℃，12 000×g离心5 min，将分层后的溶液上清转移到无菌1.5 mL离心管，酚氯仿法抽提RNA，得到沉淀后用20μL DEPC溶解，琼脂糖凝胶电泳观察RNA纯度及完整性，紫外分光光度计测定RNA浓度。取2μg的总RNA，反转录制备cDNA，特异反转录引物：H.sapiens 6 snRNA：5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′，miR-145：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAAGGGAT-3′，取2μL反转录产物作为PCR反应模板，荧光定量法检测miR-145含量。2ΔΔCt法分析定量结果，内参选用U6（NM_001101.3）。PCR反应引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′；miR-145上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。PCR反应使用20μL体系，其中，SYBR Premix Ex Taq 10μL，引物（20μmol/L）各取0.2μL，模板使用量为2μL，反应体系用无菌水补足。PCR反应条件：95℃变性10 s；58℃退火10 s；72℃延伸10 s，循环数设置为40。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 has-miR-145与Sp1靶位关系验证

2.1.1 荧光素酶报告基因表达载体构建 通过PCR扩增得到特异的PCR产物，经过与DNA标准参照物比对，其长度与理论值（219 bp）完全相符（图2）。成功构建野生型荧光素酶报告基因表达载体，并通过点突变成功构建突变型荧光素酶基因表达载体，测序分析结果显示，与标准序列完全一致（图3）。

图2 琼脂糖凝胶电泳PCR产物

图3 野生型、突变型荧光素酶报告基因表达载体序列分析

2.1.2 转染后各组细胞的荧光素酶活性 9组293细胞转染48 h后，荧光素酶相对活性检测结果显示，与野生型报告基因单独转染组（293+pGL3-WT）比较，miR-145-拟似物（293+pGL3-WT+miR-145拟似物）能够明显抑制野生型荧光素酶报告基因表达载体的荧光素酶活性（P＜0.01），而miR-145阻遏组（293+pGL3-WT+miR-145阻遏物）野生型荧光素酶报告基因表达载体的荧光素酶活性则明显上升（P＜0.01）。突变性荧光素酶报告基因表达载体单独转染组（293+pGL3-MT）与miR-145拟似物共转染组（293+pGL3-MT+miR-145拟似物）荧光素酶活性间的差异无统计学意义（P＞0.05），miR-145阻遏物转染（293+pGL3-MT+miR-145阻遏物）对突变型荧光素酶报告基因活性也无明显影响（P＞0.05）；miR-145-NC与pGL3-WT共转染组（293+ pGL3-WT+miR-145-NC）对野生型荧光素酶报告基因表达载体转染组荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05），miR-145-NC与pGL3-MT共转染组（293+ pGL3-MT+miR-145-NC）对突变型荧光素酶报告基因表达载体转染组荧光素酶活性亦无明显影响（P＞0.05），说明RNA转染本身对荧光素酶活性无影响。以上数据和结果说明，has-miR-145与Sp1基因之间的预测靶位确实存在。见图4。

图4 9组293细胞的荧光素酶相对活性的比较

2.2 转染后各组A549细胞内Sp1蛋白的含量

蛋白质印迹法检测结果显示，转染48 h后，与转染对照组比较，阻遏组细胞内Sp1蛋白含量明显增加（P＜0.05），而拟似组细胞内Sp1蛋白含量明显降低（P＜0.01）。转染对照组与阴性序列转染组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明Lipofectamine 2000转染试剂及转染过程对A549细胞内Sp1蛋白表达无明显影响。见图5。

图5 4组A549细胞中Sp1蛋白的表达

2.3 miR-145含量变化对A549细胞增殖活性的影响

细胞活性检测结果（图6）显示，转染后48 h和72 h，与转染对照组比较，拟似组A549细胞增殖活性明显降低（P＜0.05和0.01），而阻遏组细胞增殖活性在转染72 h后，明显高于转染对照组（P＜0.05）。转染后24，48和72 h，收集细胞，使用实时荧光定量PCR检测转染后miR-145含量。结果显示，转染后各个时间段，拟似组细胞内的miR-145表达量均明显高于转染对照组（P均＜0.05）。而阻遏组miR-145的表达均明显低于转染对照组（24 h和72 h时P＜0.05，48 h时P＜0.01）。阴性对照组和转染对照组3个时间点miR-145表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 m iR-145含量变化对A549细胞增殖活性的影响

3 讨论

miRNAs是一类分布广泛的内源性非编码RNA，核酸长度一般为20～25个碱基。miRNAs具有高度保守的遗传学特性，通过与基因3′-UTR区的靶点结合，对基因进行转录后调控［11］。miRNA的表达与多种肿瘤的进展及预后相关，可作为肿瘤的标志分子［12-15］。研究显示，固有的miRNA调控机制失常是多种肿瘤中癌基因及抑癌基因异常表达的内在原因［16-17］。

Sp1是存在于哺乳动物细胞中的一种基因调控蛋白，特异性地结合在受调控的基因启动子区域，选择性活化启动子引导的基因转录。Sp1在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤浸润、转移及患者预后差等密切相关，提示Sp1在肿瘤发生、发展中亦起重要作用。针对Sp1的研究，多以Sp1作为转录因子对其下游基因的转录后调控展开，而对于Sp1蛋白本身异常的原因，目前尚未见报道。寻找Sp1在肿瘤中异常的原因，才能追根溯源，为肿瘤的基因治疗提供理论基础。近几年来miRNAs与肿瘤的关系始终是肿瘤研究领域的热点，已有报道显示miRNAs通过Sp1对多种肿瘤产生调控作用［18-20］。鉴于miR-145与Sp1在A549细胞中表达具有显著相关性，我们有理由相信，miR-145可能通过对Sp1的表达调控影响肺癌细胞A549的生物学功能。

本研究在miR-145与Sp1表达具有相关性的基础上，通过生物信息学方法寻找两者的结合位点，并通过荧光素酶报告基因实验进行位点验证。在此基础上，尝试通过干预miR-145含量肺癌细胞产生影响的作用途径，并最终通过miRNA调控理论来解释miR-145-Sp1与A549细胞之间的关系。研究中，首先利用miRNA靶位的生物学预测在线软件TargetScan进行分析，发现在Sp1的3′-UTR有两处位置存在hsa-miR-145的结合位点，位于序列保守区（3′-UTR的第3481-3487位）。进一步通过荧光素酶报告基因验证预测的理论几何位点，miR-145可以通过其位于保守区的结合位点，结合于3′-UTR，并对其上游基因翻译产生抑制作用。而非保守区位点为无效位点，之所以出现这样的原因，可能与位点所处位置有关，另外，从miRNA进化角度考虑，其对于靶基因结合区域的物种间保守性也是要求较高的。

本实验通过脂质体转染法转染miR-145拟似物和阻遏物到A549细胞，Sp1蛋白含量检测结果说明，通过质粒转染的方法可以在A549细胞中抑制或增强Sp1蛋白的表达。其中拟似物转染组胞内Sp1蛋白含量较转染对照组明显下降，而阻遏物转染组细胞内Sp1蛋白含量较转染对照组明显上升。细胞增殖活性检测结果则表明，过表达miR-145可明显抑制细胞增殖活性，抑制miR-145则增强肿瘤细胞增殖活性。miR-145含量检测结果显示，在转染后48 h，拟似物转染组细胞内miR-145成熟体含量明显上升，而阻遏物转染组细胞内miR-145含量则较转染对照组明显下降。这些实验结果和数据提示，miR-145的异常表达可能是A549细胞中Sp1基因异常的关键原因。事实上，通过干预肿瘤细胞内miR-145的含量改变Sp1蛋白表达，从而调节肿瘤细胞A549的增殖也经本实验证实。本研究的意义在于证实miR-145是肺癌细胞中Sp1基因异常表达的主要调控因素之一，这为以新的基因为靶点的药物开发提供了思路。

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M echanism ofm iRNA-145 inhibits cell proliferation of A549 cells

WANG Dan
（Department of Neurobiology，the Second Military Medical University，Shanghai200433，China）

Objective：To investigate the mechanism underlying how miR-145 inhibits cell proliferation in A549 cells.M ethods：The putativemiR-145 binding sites in the 3′-UTR region of Sp1 gene were predicated by bioinformatics and was predicted by a luciferasemethod.miR-145 levelsweremeasured by qPCR and Sp1 protein levels weremeasured by Western blotting after transiently transfected with eithermiR-145 mimics or inhibitors into A549 cells.MTT assayswere employed to evaluate cell proliferation in A549 cells simultaneously at 24，48 and 72 h after transfection.ResultsThrough report of luciferase analysis，the study successfully predicted and verified the putative miR-145 binding site in the 3′-UTR of human Sp1 gene.The luciferase activity of the wild type is reported that it could be significantly reduced and induced 48 h post-transfection ofmiR-145 mimics and inhibitors respectively and it had significant difference between the above two groups（P＜0.05）.Compared to the control，transfection ofmiR-145 mimics ormiR-145-inhibitors reduced or induced Sp1 protein levelswith the significant difference（P＜0.05）.Data from real-time qPCR indicated that transfection ofmiR-145-mimics and inhibitors induced and reduced miR-145 levels respectively compared to the negative control with a significant difference（P＜0.05）.There was no significant difference between the negative control transfection group and transfection control group（P＞0.05）.Finally，transfection ofmiR-145-mimics and miR-145-inhibitor could significantly reduce and induce cell proliferation of A549 cells.Seventy-two hours post transfection，there had significant difference betweenmiR-145-mimics transfection group and the negative control transfection group（P＜0.05）.Conclusion：miR-145 inhibited cell proliferation of A549 cells through reducing Sp1 gene expression.

book=312,ebook=41

Sp1 transcription factor；A549 cell；miR-145；cell proliferation

R734.2

A

1671-7783（2015）04-0311-06

10.13312/j.issn.1671-7783.y150041

王丹（1980—），女，辽宁大连人，助理实验师，主要从事胶质环境与神经再生研究。

2015-03-06 ［编辑］陈海林