H-FABP和心肌肌钙蛋白Ⅰ二联试纸条的制备

顾梅，阮秀清，康淑娟，刘宏飞，余江南

（江苏大学1.药学院，2.京江学院，江苏镇江212013）

H-FABP和心肌肌钙蛋白Ⅰ二联试纸条的制备

顾梅1，阮秀清1，康淑娟2，刘宏飞1，余江南1

（江苏大学1.药学院，2.京江学院，江苏镇江212013）

目的：制备能够同时检测心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）的二联试纸条，用于急性心肌梗死的早期和中期辅助诊断。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，并对其相关因素进行考察。将胶体金分别与H-FABP和cTnⅠ的单克隆抗体结合，优化胶体金与单克隆抗体结合的影响因素；将胶体金结合物喷于玻璃纤维膜上制成金标垫，再分别将另一亚型cTnⅠ和H-FABP单克隆抗体和羊抗鼠IgG包被检测线T1、T2和质控线C，最后与吸水垫、经预处理的样品垫和底板组装成二联试纸条。结果：制备的二联试纸条检测H-FABP的灵敏度为10 ng/mL，检测cTnⅠ的灵敏度为3.0 ng/mL，10 min内可判定结果，层析速度均匀，没有背景颜色，两种蛋白之间无交叉反应，二联试纸条稳定性好。结论：成功制备灵敏度高、层析速度均匀和稳定性好的H-FABP/cTnⅠ二联胶体金免疫层析试纸条。

心型脂肪酸结合蛋白；心肌肌钙蛋白Ⅰ；试纸条；心肌梗死；胶体金免疫层析；双抗夹心法

心型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，H-FABP）是一类低分子质量的新型细胞质蛋白质，大量存在于心脏，占胞质蛋白的15%，少量存在于血液和心脏以外的组织中，血浆参考浓度是1.1～2.1 ng/mL，上限是5 ng/mL［1-8］。血流中乳糜微粒和极低密度脂蛋白释放出的脂肪酸通过细胞表面的脂肪酸转运蛋白进入细胞内后，经HFABP摄取并转运至线粒体，从而进入能量代谢体系并最终生成三磷腺苷（ATP），为心肌收缩提供能量［9］。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）或心肌缺血时，心肌细胞损伤，细胞膜通透性增加，H-FABP由于相对分子质量小，且为水溶性，可迅速被释放进入血液，在心肌细胞损伤发生1.5 h后出现在血浆中，6 h浓度达到高峰，随后逐渐下降，24～30 h后回到基线值［1，3］。H-FABP如此迅速恢复至正常水平得益于其高肾清除率，因此是AMI早期诊断的标志物［10-11］。

心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）具有高度的心肌特异性、对心肌损伤程度的高度敏感性及较长的诊断窗口期，正逐渐取代肌酸激酶（CK）同工酶-MB，成为诊断心肌损伤，特别是心肌梗死的特异性标志物。cTnⅠ特异存在于心肌细胞胞质，在心肌细胞膜完整状态下，不能通过细胞膜进入血循环，所以健康人血内不含或含甚少的cTnⅠ。心肌肌钙蛋白在心肌受损后，特别是心肌梗死发生后，能很快地释放入血，3～6 h出现异常增高，11～24 h达峰值，可超过正常的40倍，持续7～9 d，检测窗口长［12］。2007年10月欧洲心脏病学会（ESC）、美国心脏病学会（ACC）、美国心脏协会（AHA）和世界心脏联盟（WHF）组成工作小组发布了“心肌梗死全球统一定义”标准，推荐使用cTn诊断AMI。

胶体金免疫层析试纸条是将具有特异性的物质和IgG分别固定在NC膜上作为T线和C线，胶体金标记物喷涂在结合物垫上，与加在样品垫上的待测样品结合，通过毛细管作用向前移动，与NC膜上的蛋白结合，形成聚合物，聚集在相应区域形成视觉可见的红色条带［13-14］。胶体金免疫层析技术具有检测快速、制备简便、灵敏度高等优点，同时HFABP/cTnⅠ二联胶体金试纸条可以同时检测HFABP和cTnⅠ这两种蛋白，因此可以同时监测AMI的早期和中期状况，配合相关检测仪器，可以定量检测H-FABP和cTnⅠ的浓度，为急性心肌梗死的诊断提供一种快速、简便的方法，有良好的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

氯金酸、枸橼酸三钠、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白钠（Casein Na）均购自上海捷宁生物有限公司；H-FABP单抗和抗原、cTnⅠ单抗和抗原均购自海肽生物科技有限公司；羊抗鼠IgG、胶体金、样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫和底板均购自上海杰一生物有限公司。其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玻璃器皿的准备 将玻璃器皿用双蒸水清洗3遍，放在100℃烘箱里烘干，再放入王水（V浓HCl∶V浓HNO3=3∶1）中浸泡24 h后，继续用双蒸水清洗3遍，放在100℃烘箱烘干，备用。

1.2.2 胶体金制备条件的优化 胶体金的制备需要考察4个单因素，分别是枸橼酸钠的量、首次沸腾时间、第2次沸腾时间和转速。实验步骤：取40 mL 1%的氯金酸溶液放入经王水洗净并干燥过的50 mL锥形瓶中，分别置于恒温加热磁力搅拌器上加热，并精确调节搅拌速度R（r/min），在加热沸腾t1（min）后，分别一次性快速加入新鲜配制的1%枸橼酸三钠（mL）。溶液的颜色一般由黄色→灰色→黑色→紫黑色→紫色→酒红色变化，加入枸橼酸三钠t2（min）后，停止加热，将溶液冷却至室温后，加双蒸水至溶液体积为40 mL，最后进行质量鉴定。4个单因素变量见表1。

表1 胶体金制备的单因素考察

1.2.3 胶体金质量鉴定方法［15-16］

1.2.3.1 肉眼观察胶体金溶液 观察制得的胶体金溶液颜色、均匀度和透明度，初步判断其质量，如10～20 nm颗粒胶体金是樱桃红，20～40 nm颗粒胶体金是酒红色，40 nm以上的胶体金是紫红色。如果出现蓝色、白色或者浑浊，说明制备的胶体金质量差，或者可能是玻璃器皿未洗干净，污染了胶体金溶液，破坏了胶体金的稳定结构。

1.2.3.2 紫外光谱扫描鉴定 将制备好的胶体金溶液用双蒸水稀释5倍，在400～600 nm可见光范围内进行紫外可见光扫描。一般胶体金的最大吸收峰在520～530 nm，峰型左右基本对称。观察紫外吸收峰的峰形和峰宽大小。通过测定最大吸收峰波长，确定胶体金颗粒的大小。

1.2.3.3 透射电镜观察 透射电镜下分别在200、250、300 kV观察胶体金的颗粒形态、大小及均匀度等。取10μL的样品点在铜网上，放置在培养皿中室温干燥后，加1滴2%的磷钨酸，室温干燥后，在透射电镜中检测。理想的金颗粒大小基本相等、均匀一致、无椭圆形及多角形的金颗粒存在。

1.2.4 胶体金和蛋白结合的条件优化 将一定量的20 mmol/L K2CO3溶液滴加到装有1 mL胶体金的离心管，混匀后每只离心管各继续加入一定量的单克隆抗体，稍等片刻（t1），混合均匀，再加入0.5 mL的10%NaCl，静置片刻（t2）。观察胶体金颜色变化，并再加入3mL双蒸水稀释，扫描紫外光谱并在530 nm测定D值，以单因素和D值分别为横纵坐标作曲线，取曲线斜率最低点处为单因素最适值。此实验步骤共考察两个单因素，分别为最佳pH值（20 mmol/L K2CO3的量）和最适蛋白量，其变量见表2。

表2 胶体金和蛋白结合的单因素考察

1.2.5 胶体金和蛋白结合物的制备 按照上述实验确定好的最佳pH值和蛋白量进行标记，将抗HFABP单抗和抗cTnⅠ的单抗分别加入胶体金溶液中，30 min后加入BSA，继续静置30 min，将标记好的胶体金蛋白结合物溶液置于恒温离心机中，6 000 r/min，4℃离心15 min；吸出上清液再以8 400 r/ min，4℃离心30 min，两次都保留金标沉淀。

1.2.6 金标恢复液的优化 将制备的金标沉淀，按照30%V金标沉淀+70%V金标恢复液（V表示体积）的比例制备喷金液（金标恢复液1号是含有1%BSA、0.05%PEG和0.1%Tween-20的Tris-HCl液，2号是1%的酪蛋白、15%的海藻糖和30%的蔗糖，3号是1%的酪蛋白、15%的蔗糖和1%的PVP），将已经制备好的胶体金-蛋白结合物用移液器均匀涂在经过预处理的结合垫上，其他条件不变，将结合垫与NC膜、样品垫、吸水垫和PVP板组装，切成4 mm宽的试纸条，按照结合垫在层析5 min时的层析速度以及残留物的多少选择金标恢复液。

1.2.7 NC膜单克隆抗体的包被 将浓度为0.8 mg/mL的羊抗鼠IgG包被在C线上，浓度为3 mg/ mL的cTnⅠ和0.2 mg/mL的H-FABP单抗分别包被在T1线和T2线，放置在37℃烘箱里1.5～2 h后取出，放置在塑封袋内备用。

2 结果和讨论

2.1 胶体金的制备条件优化

2.1.1 枸橼酸钠量的优化 胶体金颗粒的大小主要受柠檬酸三钠量的影响，枸橼酸钠量越多，制备所得的胶体金颗粒的粒径越小，紫外光谱扫描所得的可见吸收峰值越小。当加入枸橼酸钠的量从0.15 mL逐渐增加到1 mL时，制得的胶体金颗粒的颜色从咖啡色、玫红色到桃红色变化（图1）。因此可以通过加入不同量的枸橼酸钠制备不同大小胶体金颗粒。本实验需要制备40 nm的胶体金颗粒，根据购自上海杰一公司的胶体金颗粒的吸收峰值在530 nm，本实验加入1%枸橼酸钠的量应选择0.5 mL来还原40 mL的0.01%的氯金酸溶液。

图1 枸橼酸钠量对胶体金颗粒粒径的影响

2.1.2 第1次沸腾时间的优化 沸腾2 min后加枸橼酸钠制得的胶体金呈玫红色，而在氯金酸沸腾后立刻加枸橼酸钠所制得的胶体金为酒红色，更加接近购自杰一公司的胶体金颜色。紫外扫描光谱图中峰半宽越小，表示制得的胶体金颗粒的粒径分布越均匀，在氯金酸加热沸腾后立刻加入枸橼酸钠制得的胶体金颗粒的粒径分布更加均匀。见图2。因此第1次沸腾时间选择0 min。

图2 首次沸腾时间对胶体金颗粒粒径的影响

2.1.3 第2次沸腾时间的优化 第2次沸腾时间不同所制得的胶体金颜色相差不大；当加入枸橼酸钠后沸腾10 min时，所制得的胶体金的半峰宽最小，此条件下，胶体金粒径分布更加均匀，因此第2次沸腾时间选择10 min。见图3。

图3 第2次沸腾时间对胶体金颗粒均匀度的影响

2.1.4 转速的优化 当转速为300 r/min时，半峰宽最小，胶体金颗粒的粒径分布最均匀；当转速为100 r/min时，胶体金的颜色为玫红色；当转速为300 r/min时，胶体金颜色为酒红色，接近杰一公司的产品。因此，应选择300 r/min的转速。见图4。

2.1.5 胶体金颗粒的检验 本实验制备的胶体金颗粒的颜色与杰一公司相像，通过透射电镜可以观察到胶体金颗粒分布均匀，粒径在40 nm左右（图5）。

图4 胶体金制备转速的优化

图5 制备的胶体金颗粒（透射电镜×30万）

综上分析，经过可见光吸收光谱和透射电镜判断，选择本实验胶体金制备的最佳条件为40 mL的0.01%氯金酸水溶液在300 r/min的搅拌速度加热至沸，沸腾后立即加入枸橼酸钠还原剂，反应10 min后停止搅拌，室温冷却，并定容至40 mL，储存备用。

2.2 胶体金和蛋白结合

2.2.1 最佳pH值 采用K2CO3调节pH值，通过目测法得知，当pH太小或者太大时，胶体金都会变色。原因是pH小于单抗的等电点p I，单抗带正电荷，胶体金带负电荷，两者结合过强形成聚合物而聚沉；当pH值远大于单抗的等电点p I，溶液碱性太强，单抗带负电荷，胶体金也是负电荷，相互排斥而不能结合。在加入NaCl盐离子时，由于单抗不能保护胶体金而使胶体金聚集沉淀变成蓝色；而pH值在标记蛋白的等电点或略偏碱性，与胶体金静电结合，单抗保护了胶体金，在加入NaCl盐离子时，颜色不变。由图6可知，H-FABP的1，2，5，6，8号试管变色，因此检测3，4和7号试管的D值；cTnⅠ的1号和5～7号试管变色，因此检测2～4号管的D值。由测得的D值看，标记H-FABP的20 mmol/L K2CO3的加入量为30μL，cTnⅠ的20 mmol/L K2CO3的加入量为35μL（表3），其D值最大，胶体金和蛋白结合的酸碱环境最佳。

图6 在不同的pH值下结合两种蛋白后的胶体金颜色

表3 胶体金溶液的D值对应的K 2 CO3体积

2.2.2 最佳蛋白量 当单抗量比较少时，胶体金变色，而随着单抗量增加，胶体金颜色不变，原理是胶体金是一种带负电的疏水性颗粒，未加单抗或加入的单抗量不足时，胶体金和蛋白结合未达到饱和，蛋白没有完全保护胶体金，有胶体金结合位点裸露，当加入NaCl后由于盐离子效应，会改变胶体金的性质，出现由红变蓝的聚沉现象，这种情况下试纸条的灵敏度降低甚至出现假阳性。由图7可知，H-FABP的1号和2号试管变色，因此对3～6号试管检测紫外吸收峰值（D值）；cTnⅠ的1号和2号试管变色，同理检测3～5号试管紫外吸收峰值（D值）。当HFABP的单抗量为3μL，cTnⅠ的单抗量为2.5μL，其D值最大（表4）。最佳蛋白量一般在此基础上增加20%，因此，H-FABP的最佳蛋白量是3.6μL，cTnⅠ的最佳蛋白量为3μL。

图7 加入不同量蛋白的胶体金颜色

表4 不同蛋白量测得的D值

与图5中显示的颗粒比较，胶体金蛋白结合物（GNP）的直径有所增加，而且在胶体金外围有白色的环（图8），表明蛋白已经通过静电吸附在胶体金表面，胶体金和H-FABP、cTnI的偶联率达100%［17］。

2.3 金标恢复液的优化

金标恢复液可以使高速离心完的胶体金结合物重悬于液体中，形成溶液，在4℃环境下可以长期放置，而且在制成成品试纸条时可以长期保持活性，延长有效期。本实验考察3种不同的恢复液，以稳定性作为标准来确定最终的恢复液。

图8 胶体金蛋白结合物（透射电镜×60万）

由图9可知，试纸条放置1周后，1号的残留物很多，2号和3号残留物明显较少。我们在实验中发现，3号点样后，液体在结合垫停留的时间很长，层析效果不好。因此，选择2号金标恢复液。可能原因是胶体金结合物在干燥过程中与结合垫结合了，而2号的恢复液中有海藻糖或者蔗糖，在结合垫表面形成一层光滑的薄膜，防止胶体金结合物缀合在结合点上，同时，光滑的薄膜极易水解，有利于胶体金结合物释放进入样品液中，并随之层析到NC膜中，因此，可以提高灵敏度、层析速度等［18］。1号恢复液中不含有糖类，不能在结合垫形成一层光滑的薄膜，因此金标残留物最多；3号恢复液中含有的糖类比2号少，因此金标残留物比2号多。

图9 3种金标恢复液的考察结果

2.4 二联试纸条的层析结果

由图10可知，阴性样品点样时，只有C线显色，T1和T2未显色；当样品中只有H-FABP时，C线和T2线显色；当样品中只有cTnⅠ时，C线和T1线显色；当样品中既有H-FABP，又有cTnⅠ时，C线、T1线和T2线都显色。这说明H-FABP和cTnⅠ之间没有干扰，这两种蛋白可以合并在一条试纸条上一起检测。这样可以减少取样量，减少患者的痛苦，节省检测时间，减少了AMI诊断时间和医疗费用。

图10 H-FABP和cTnⅠ的试纸条

3 结论

本实验制备胶体金采用的柠檬酸三钠还原法，影响胶体金颗粒大小的因素是氯金酸与枸橼酸钠量的比值。当氯金酸量一定时，枸橼酸钠量越多，制备所得的胶体金颗粒的直径越小；而其他影响因素如磁力搅拌的速度、沸腾时间等主要影响胶体金颗粒的质量。当这些条件处于最优时，制备的胶体金颗粒大小均匀，呈类似圆形或者椭圆形。胶体金与蛋白结合的pH值应处于蛋白的pI或者略大于pI值，此时因为静电吸附，蛋白包裹在胶体金的周围形成稳定的结构。

胶体金免疫层析技术是以双抗夹心法为原理，如果待测样品中有H-FABP和cTnⅠ的抗原时，当液体层析到结合垫时，两种抗原分别与相应的胶体金结合物特异性结合。cTnⅠ的结合物在NC膜上通过毛细管作用层析到T1线，又与包被在T1线的单克隆抗体特异性结合，形成类似“三明治”的结构，因此出现肉眼可识别的红色条带。样本中cTnⅠ的浓度越高，检测线区出现红色带的时间越短、显色越深［3］。T2线同理。不论待测样本中是否存在 HFABP或者cTnⅠ，当层析液继续迁移至C线（包被羊抗鼠IgG抗体）时，在该区出现另一条红色带，C线的条带颜色不会随着抗原浓度的增加而增加，只跟包被在C线的羊抗鼠IgG的浓度有关。该二联试纸条具有检测准确、快速等特点，不仅适合于医院的急诊室及床边检测，而且也适合家庭等任何场所的检测，可用于早期和中期AMI的辅助诊断，并为定量诊断提供了前期基础。

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Preparation of heart-type fatty acid-binding protein and cardiac troponinⅠbivalent strip

GU Mei1，RUAN Xiu-qing1，KANG Shu-juan2，LIU Hong-fei1，YU Jiang-nan1
（1.School of Pharmacy，2.Jingjiang College，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To develop the bivalent strip of human heart-type fatty acid binding protein（HFABP）and cardiac troponinⅠ（cTnⅠ）using colloidal gold immunochromatography technology with principles of double-antibody sandwich assay，for the early and mid-assisted diagnosis of acutemyocardial infarction.M ethodsThe colloidal gold was prepared by trisodium citrate reduction method，and its related factors were investigated.Colloidal gold particles labelled withmonoclonal antibody of H-FABP and cTnⅠ，respectively，were coated on some glass fiber and dried；similarly，its factorswere optimized.The othermonoclonal antibody of cTnⅠ，H-FABP and goat anti-mouse IgG were blotted on the test one line，test two line and control line of nitrocellulose membrane，which were prepared with the absorbent pad，the pretreated sample pad and PV floor into a bivalent strip.Results：The test strip of H-FABP and cTnⅠdetection sensitivity was 10 ng/mL and 3.0 ng/mL，respectively，the result can be determined within 10 min，that have uniform speed chromatography，no background，no crossover between the two proteins response and good stability.Conclusion：It prepared H-FABP/cTnⅠcolloidal gold bivalent strip of high sensitivity，uniform speed chromatography and good stability，successfully.

heart-type fatty acid-binding protein；cardiac troponinⅠ；strip；myocardial infarction；gold immunochromatography；sandwich method

R541；R446.61

A

1671-7783（2015）04-0349-07

10.13312/j.issn.1671-7783.y150035

江苏省高等学校大学生创新创业训练计划资助项目（201413986014X）

顾梅（1988—），女，硕士研究生；余江南（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：gm15052926912@163.com

book=355,ebook=84

2015-03-09 ［编辑］陈海林