利用苹果渣发酵生产细菌纤维素工艺及产物性能研究

张　雯，葛万云，齐香君（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021）

利用苹果渣发酵生产细菌纤维素工艺及产物性能研究

张雯，葛万云，齐香君
（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021）

摘要：为提高木醋杆菌（Acetobacter xylinum）发酵苹果渣生产细菌纤维素（Bacterial cellulose，BC）的生产效率，采用单因素及正交实验对纤维素酶水解苹果渣工艺进行优化，同时利用傅里叶红外光谱（FT-IR）和X-射线衍射（XRD）对发酵产物BC的性能和结构进行比较。单因素及响应面实验结果确定苹果渣最优水解工艺：液固比4 mL/g，酶用量16.8 EGU/g，pH5.5，水解温度55℃，水解时间40 h。此条件下，苹果渣水解产生还原糖产率为38.02%。苹果渣水解液发酵产物BC结构性能与基本培养基发酵产物BC基本一致。研究结果表明苹果渣能够作为发酵原料发酵生产BC，且不影响BC性能。

关键词：苹果渣；细菌纤维素；纤维素酶；正交试验

细菌纤维素（Bacterial cellulose，简称BC）是由生长在液态含糖基质中的革兰氏阴性菌产生的纤维素成分。与植物纤维素相比，BC不含半纤维素和木质素，具有高持水率（大于90%）、高分子量以及较高的结晶度。目前，BC作为一种新型功能材料受到了科学界的广泛关注，已成功地应用于食品、生物医学、膜滤器等多个领域[1-2]。目前BC的生产原料大多为椰汁或复合培养基，主要集中在东南亚等国家。单一的生产原料及地域限制使BC存在生产及运输成本过高等问题，只能应用于高附加值产品的开发。降低生产成本、摆脱原料地域限制是我国BC产业面临的一个重大挑战[3]。苹果渣是苹果汁加工业的副产物，富含碳水化合物、矿物质等多种营养成分[4]。其直接废弃，造成了严重的资源浪费和环境污染。苹果渣中含有的纤维素，经过适当处理后，可以转化为小分子糖，另外，它含有的微量矿物质也是微生物生长繁殖的理想原料。Joshi V.K. 等[7]将苹果渣分别接入啤酒酵母、产朊假丝酵母、产蛋白酵母等进行固态发酵，Sandhu等[8]利用酵母发酵苹果渣产生乙醇、粗蛋白和可溶蛋白。本研究拟利用苹果渣水解液作为原料生产BC，采用单因素及正交试验对苹果渣水解工艺进行优化。同时研究发酵产物BC性能，探索苹果渣作为发酵原料对BC的影响。本研究可为BC发酵提供一种廉价原料，为苹果渣的综合利用、附加值的提升和果汁的清洁化生产提供一条新的途径，具有良好的社会效益及经济效益。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1菌种

木醋杆菌（Acetobacter xylinum）；苹果渣：陕西海升果业发展股份有限公司；纤维素酶（700 EGU/g）：诺维信中国生物技术有限公司；其余试剂均采用国产分析纯或生化试剂。

1.1.2培养基

基本培养基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氢二钠4.40g、柠檬酸0.80g、乙醇10mL、自来水1000mL、pH 6.0；苹果渣水解液发酵培养基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氢二钠4.40 g、柠檬酸0.80 g、乙醇10 mL、苹果渣水解液1 000 mL、pH6.0。

1.1.3仪器

D/max2200PC全自动X-射线衍射仪：日本Rigalcu；VERTEX 70傅立叶变换红外光谱仪：德国Brucher公司；MG250B恒温培养箱、HYG-1A恒温振荡器：上海新瑞仪器有限公司；752型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1测定分析方法

1.2.1.1还原糖的测定

采用DNS法[9]。

1.2.1.2BC膜处理

将发酵所得BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中，80℃浸泡30 min，继续加热煮沸2 h，再用蒸馏水反复冲洗，直到pH为7.0，冷冻干燥[9]。

1.2.1.3BC膜产量测

采用称重法[9]。

1.2.1.4BC鉴定及基团分析

采用傅里叶红外光谱扫描法[9]（样品处理：取适量BC干膜放入红外光谱仪中进行测定，450 mW，扫描范围4 500 cm-1～400 cm-1，设定分辨率4 cm-1，扫描速度为0.2 cm/s，室温下操作）。

1.2.1.5BC膜结晶度

采用X-射线衍射光谱扫描法[9]（样品处理：BC干膜平整固定在样品架上，铜靶，测试电压40 kV，测试电流100 mA，速率5°/min，步宽0.02°，2θ为0～80°范围扫描。根据X衍射参数，由下面两个计算公式分别计算细菌纤维素的结晶度（Xc）和晶体的粒径L；

式中：I为衍射峰的衍射强度；Iam为无定形区衍射强度；β为半峰宽（rad）；k为常数，通常取0.89；λ为X射线波长（0.154 06 nm）；θ为布拉格衍射角。

1.2.2BC的发酵

移取木醋杆菌种子液接入发酵培养基，装液量30 mL/250 mL三角瓶，接种量20%，30℃恒温培养箱中静置培养10 d。

1.2.3纤维素酶水解苹果渣单因素试验

1.2.3.1固液比对苹果渣水解的影响

取经粉碎干燥的苹果渣5.00 g，加自来水至液固比分别为3、4、5、6、7 mL/g，加纤维素酶至终浓度为40.00 EGU/g，pH 5.2～5.5、55℃水解14 h，反应结束后升温至100℃，维持10 min灭酶，得苹果渣水解液。以水解液中还原糖的产率为指标考察不同固液比对纤维素水解效率的影响。

1.2.3.2酶用量对苹果渣水解的影响

按照以上试验优化工艺，考察纤维素酶终浓度为6.72、10.08、13.44、16.80、20.16 EGU/g时，对纤维素水解效率的影响。其余工艺同1.2.3.1。

1.2.3.3pH对苹果渣水解的影响

按照以上试验优化工艺，用ω（NaOH）=3%的溶液调整pH，考察pH分别为3.5、4.5、5.0、5.5、6.5时，对纤维素水解效率的影响。其余工艺同1.2.3.1。

1.2.3.4温度对苹果渣水解的影响

按照以上试验优化工艺，考察水解温度分别为35、45、50、55、65℃时，对纤维素水解效率的影响。其余工艺同1.2.3.1。

1.2.3.5水解时间对苹果渣水解的影响

按照以上试验优化工艺，考察水解时间分别为6、12、24、48、72、96、120 h时，对纤维素水解效率的影响。其余工艺同1.2.3.1。

1.2.4纤维素酶水解苹果渣正交试验

根据单因素试验结果确定正交试验考察因素及水平，确定纤维素酶水解苹果渣最优工艺。

1.2.5发酵产物性能研究

以木醋杆菌（Acetobacter xylinum）为菌种，按照优化工艺制备苹果渣水解液，配制发酵培养基发酵生产BC，记为BC-YP，利用基本培养基发酵生产BC记为BC-DZ。利用傅里叶红外光谱仪（FT-IR）及X-射线衍射仪（XRD）对BC-YP及BC-DZ进行检测，研究苹果渣水解液作为发酵培养基原料对BC性能的影响。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

液固比对苹果渣水解的影响如图1所示。

图1　液固比对苹果渣水解的影响Fig.1　Effect of liquid-solid ratio on pomace hydrolyzing

由试验过程可知，液固比不同，苹果渣形态也不相同。液固比为3 mL/g时，苹果渣不能被完全润湿；液固比为4 mL/g时，苹果渣充分润湿，呈松散状；液固比为5 mL/g时，苹果渣呈糊状；液固比大于6 mL/g时，苹果渣成为悬浮液。由图1可知，苹果渣水解过程中，液固比为3 mL/g时，纤维素水解成还原糖的产率较低。随着液固比的增大，还原糖产率变化显著提高，当液固比达到4 mL/g以上时，苹果渣能够被完全润湿，继续增加液固比对还原糖产率影响不大。考虑到提高水解效率的同时减少水用量，选择液固比4 mL/g为较佳参数。

酶用量对苹果渣水解的影响如图2所示。

图2　酶用量对苹果渣水解的影响Fig.2　Effect of celluclast dosage on pomace hydrolyzing

由图2可知，随着纤维素酶用量的升高，还原糖产率也逐渐升高。当酶用量达到16.8 EGu/g以上时，还原糖产率的升高随酶用量的变化趋于平缓。综合考虑水解效率和成本因素，选择酶用量16.8EGU/g为较佳参数。

pH对苹果渣水解的影响如图3所示。

图3　pH对苹果渣水解的影响Fig.3　Effect of pH on pomace hydrolyzing

不同pH条件下，纤维素酶表现出不同的酶活性。由图3可知，水解pH为5.0左右时，纤维素酶具有较高活性，此条件下进行苹果渣的水解，还原糖产率最高。选择pH5.0为较佳参数。

温度对苹果渣水解的影响如图4所示。

图4　水解温度对苹果渣水解的影响Fig.4　Effect of hydrolytic temperature on pomace hydrolyzing

由图4可知，曲线顶点对应的温度50℃即为纤维素酶水解苹果渣的最适反应温度，在低于或高于50℃时，纤维素酶的水解能力均有所降低，高温时更为明显，可能是过高的温度引起酶蛋白的变性所致。

水解时间对苹果渣水解的影响如图5所示。

水解时间在48 h之内时，还原糖产率随水解时间的延长呈显著升高趋势，48 h以后，还原糖产率上升速率减慢，继续延长水解时间不能得到更高还原糖产率。选择水解时间48 h为较佳参数。

2.2正交试验设计及结果

根据单因素试验结果，选择酶用量、pH、水解温度和水解时间四个因素进行正交试验（表1），确定苹果渣最优水解工艺，正交试验结果如表2所示。

图5　水解时间对苹果渣水解的影响Fig.5　Effect of hydrolytic time on pomace hydrolyzing

表1　正交试验设计Table 1　Design of orthogonal experiments

表2　正交试验结果及分析Table 2　Results of orthogonal experiments

取苹果渣5.00 g，按照正交试验所确定最佳工艺条件（A2B3C3D1）进行苹果渣水解，还原糖产率为38.02%，高于正交试验中各次试验的还原糖产率，试验结果与正交试验所得结论一致。

由正交试验及补充试验结果可知，影响苹果渣水解的因素显著性顺序为：pH＞水解温度＞酶用量＞水解时间。纤维素酶水解苹果渣的最优工艺为A2B3C3D1：酶用量16.8EGU/g，pH5.5，水解温度55℃，水解时间40h。2.3发酵产物的结构与性能

以木醋杆菌（Acetobacter xylinum）为菌种，按照优化工艺制备苹果渣水解液，配制苹果渣水解液发酵培养基进行BC发酵。苹果渣水解液发酵BC（BC-YP）与基本培养基发酵BC（BC-DZ）红外图谱如图6所示。

图6　基本培养基发酵BC（BC-DZ）与苹果渣水解液发酵BC（BCYP）红外图谱Fig.6　FT-IR of BC produced from basic medium（BC-DZ）andBC from pomace hydrolysate（BC-YP）

吸收峰3 285、1 154、1 077、1 040 cm-1证实了样品中大量-OH的存在；吸收峰2 925、1 383、645 cm-1证实了-CH2-、-CH-和C-H的存在；吸收峰1 241 cm-1证实了环C-O-C的存在；吸收峰1 241、1 033 cm-1证实了直链C-O-C的存在[11-12]。以上结果显示为细菌纤维素葡聚糖的特征吸收，可以推断出两种样品的主要成分均为细菌纤维素。由图6可知，BC-YP和BC-DZ红外图谱基本一致，说明两种样品的化学组成非常相似，苹果渣水解液作为发酵原料不影响BC的化学结构。

苹果渣水解液发酵BC（BC-YP）与基本培养基发酵BC（BC-DZ）XRD图谱如图7所示。

图7　基本培养基发酵BC（BC-DZ）与苹果渣水解液发酵BC（BCYP）XRD图谱Fig.7　XRD of BC produced from basic medium（BC-DZ）and BC from pomace hydrolysate（BC-YP）

由图可知，BC-YP和BC-DZ的X-射线图谱大致相同，且在相同位置处均含有主要衍射峰，分别在144.8°、16.8°和21.7°附近存在三个衍射峰，此三个峰分别对应纤维素晶体的＜101＞、＜101＞和＜002＞晶面[13]，据此可知BC-YP和BC-DZ为Ⅰ型纤维素。

两种样品的结晶度与晶体粒径的结果如表3所示。

表3　基本培养基发酵BC（BC-DZ）与苹果渣水解液发酵BC（BC-YP）XRD结果Table 3　XRD result of BC produced from basic medium（BC-DZ）and BC from pomace hydrolysate（BC-YP）

结果表明，BC-YP和BC-DZ的结晶度基本相同，均为24%左右，BC-YP粒径大于BC-DZ。结晶度与纤维的抗张强度、杨氏模量、硬度、伸长率、吸湿性、润胀度、柔软性等性质有一定的关系[14]，说明苹果渣水解液作为发酵原料不影响BC结晶度。晶体粒径与透明度、撕裂因子有关，苹果渣水解液中含有纤维素未水解完全的多糖成分，部分多糖可在BC合成过程中结合到BC中，从而改变BC的晶体粒径。

3　结论

通过单因素和正交试验对纤维素酶水解苹果渣工艺进行了优化，确定了最优水解工艺：液固比4 mL/g，酶用量16.8 EGu/g，pH 5.5，水解温度55℃，水解时间40 h。在此条件下，苹果渣水解产生还原糖产率为38.02%。利用该工艺进行苹果渣水解液的制备，用于BC的发酵生产，利用FT-IR及XRD对发酵产物BC化学基团、结晶性能进行了比较，结果表明，苹果渣水解液发酵产物BC结构性能与基本培养基发酵产物BC基本一致。研究结果表明，苹果渣能够作为发酵原料发酵生产BC，且不影响BC性能。

参考文献：

[1]Sybele S,Lucas N T,Paulo T O,et al.Bacterial cellulose-collagen

nanocomposite for bone tissue engineering[J].J Mater Chem,2012, 22(41):22102-22112

[2]Cai Zhi-jiang,Yang Guang.Bacterial Cellulose/Collagen Composite:Characterization and First Evaluation of Cytocompatibility[J].J Appl Polym Sci,2011,120(5):2938-2944

[3]赵思雨,陈仕艳,王华平.细菌纤维素的生产及其在食品工业中的应用[J].湛江师范学院学报,2013,34(6):69-72

[4]杨福有,祁周约,李彩风杨,等.苹果渣营养成分分析及饲用价值评估[J].甘肃农业大学学报,2000,35(3):340-344

[5]Sargent S A.An energy and cost analysis modelto evaluate the combustion of food processing wastes[D].E.Lansing,MI:Michigan State University,1984

[6]李彩凤,杨福有.苹果渣的营养成分及利用[J].饲料博览,2001 (2):38

[7]Joshi V K,Gupta K.Production and evaluation off ermented apple pomace in the feed of broilers[J].Journal of Food Science and Technology,2000,37(6):609-612

[8]Sandhu D K,Joshi V K.Solid state fermentation of apple pomace for concentation of ethanol and animal feed[J].Jounral of Science&Industrial Research,1997,56(2):86-90

[9]史红兵,宋纪蓉,黄洁,等.果渣制备可溶性膳食纤维的工艺研究[J].西北大学学报(自然科学版),2004(4):148-152.

[9]Chao Y,Ishida T Y,Shoda M.Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50-L internal-loop airlift reactor[J]. Biotechnology Bioeng,2000,68(3):345-352

[11]张丽平,卢红梅,彭湘屏,等.淋浇发酵法生产细菌纤维素的结构与性质研究[J].食品工业科技,2012,33(22):197-201

[12]Rajalaxmi D,Marcus F,Arthur J R.Improving the mechanical and thermal properties of gelatin hydrogels cross-linked by cellulose nanowhiskers[J].Carbohydrate Polymers,2013,91(2):638-645

[13]Pei Ying,Yang Juan,Liu Pan,et al.Fabrication,properties and bioapplications of cellulose-collagen hydrolysate composite films[J]. Carbohydrate Polymers,2013,92(2):1752-1760

[14]Saska S,Barud H S,Gaspar A M M,et al.Bacterial Cellulose-Hydroxyapatite Nanocomposites for Bone Regeneration[J].International Journal of Biomaterials,2011,5(5):1605-1613

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.027

收稿日期：2015-05-19

基金项目：陕西省科技厅自然基金项目（2012JM2005）；陕西省教育厅科研专项项目（15JK1108）；2013年国家级大学生创新创业训练计划项目（201310708014）

作者简介：张雯（1982—），女（汉），副教授，博士生，研究方向：生物制药。

Study of Process for Bacterial Cellulose Fermentation with Pomace and Properties of the Product

ZHANG Wen，GE Wan-yun，QI Xiang-jun
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：In order to increase the producing efficiency of bacterial cellulose（BC）fermented by Acetobacter xylinum using pomace，single factor and orthogonal experiments were used to optimize the hydrolysis process of pomace.Meanwhile，the properties of BC were compared through fourier transform infrared（FT-IR）and X-ray diffraction（XRD）.According to the results of experiments，the optimal hydrolysis process were determined as follows：liquid-solid ratio 4 mL/g，dosage of celluclast 16.8 EGU/g，pH5.5，hydrolytic temperature 55℃，hydrolytic time 40 h.Under these conditions，the productive rate of reducing sugar was 38.02%.The properties and structures of BC produced with pomace hydrolysate were confirmed to be basically same with BC produced with basic medium，which indicated that the pomace hydrolysate could be used as part of raw materials to ferment BC and would not affect the properties of BC.

Key words：pomace；bacterial cellulose；celluclast；orthogonal experiments