离子交换层析分离纯化发酵米糠中的Y-氨基丁酸

王姣斐，陈　野，陈远平（.武警杭州士官学校军需系，浙江杭州30023；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

离子交换层析分离纯化发酵米糠中的Y-氨基丁酸

王姣斐1，陈野2，*，陈远平1
（1.武警杭州士官学校军需系，浙江杭州310023；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

摘要：以米曲霉发酵处理的米糠为研究对象，研究发酵米糠中γ-氨基丁酸的分离纯化方法，采用超声波辅助提取对米糠发酵物进行初步提取，然后采用离子交换层析法进行纯化，提取液经过离心、脱色、脱盐等预处理，通过静态吸附实验和吸附动力学试验确定离子交换层析的最适条件。结果表明，选取732型强酸性阳离子交换树脂、上样pH为3.0、上样液浓度2 mg/mL，流速2 mL/min，洗脱液pH 8.0～10.0，收集馏分，测得其γ-氨基丁酸的纯度为73%，计算得提取纯化γ-氨基丁酸的得率为44.9%。

关键词：发酵米糠；γ-氨基丁酸；离子交换层析；分离纯化

γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是由谷氨酸通过谷氨酸脱羧酶的作用发生脱羧反应而生成[1-2]。免疫学研究表明，γ-氨基丁酸是人体中枢神经一种重要的抑制性神经递质，具有极为重要的生理功能[3-4]，在促进大脑活性、健脑益智、抗癫痫、促进睡眠、美容润肤、延缓脑衰老机制、降血压[5]等方面作用明显，同时还具有改善肾机制、抑制脂肪肝及肥胖症[6]、促进肝功能[7]等作用。目前γ-氨基丁酸的制备方法主要有植物富集法和微生物发酵法[8-10]，运用微生物发酵法生产γ-氨基丁酸是通过微生物自身酶系的脱羧作用来提高米糠中γ-氨基丁酸的含量[11]。

米糠是农业生产过程中重要的加工副产品[12]，米曲霉是食品工业中常见的微生物，主要用于生产酱油及一些生物活性物质，具有良好的蛋白酶活性[13-14]，这些都为以米糠作为原料生产γ-氨基丁酸提供了理论基础。本研究的研究对象是米曲霉发酵后的预处理米糠，主要采用超声波辅助法和离子交换层析法对发酵米糠中的γ-氨基丁酸进行分离纯化，研究分离纯化条件对γ-氨基丁酸产率的影响，为今后的规模化生产提供理论和试验支撑。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

γ-氨基丁酸标准品：美国Sigma公司；723型、734型、D001型阳离子交换树脂：天津光复精细化工研究所；发酵米糠：天津科技大学食品加工与保鲜实验室自制。

1.2仪器与设备

BS-100A型自动部分收集器：分析仪器厂有限公司；HL-2型恒流泵：上海亚荣生化仪器厂；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-3型循环水式多用真空泵：上海沪西分析仪器厂；Agilent C18色谱柱：美国Agilent仪器公司；D-2000 Elite型高效液相色谱仪：日立实验仪器设备有限公司。

1.3方法

1.3.1发酵米糠γ-氨基丁酸的超声波辅助提取

根据γ-氨基丁酸易溶于水的特性[15]，采用蒸馏水作为提取溶剂，采用超声波辅助提取法，将发酵米糠在适量蒸馏水中浸泡30 min，使发酵物固体被提取液充分润湿，设定发酵物与提取液之间适当料液比、超声时间和提取次数，得到发酵提取液，采用高效液相色谱法测定提取液中γ-氨基丁酸含量，研究不同料液比、超声时间和提取次数对提取液中γ-氨基丁酸的含量的影响。

1.3.2发酵提取液的预处理

准确称取50.000 g发酵物，加入适量蒸馏水，超声提取30 min，混合物离心取上清液，滤渣与适量蒸馏水混匀，超声辅助提取30 min，合并收集两次提取上清液，定容至500 mL容量瓶。上清液60℃真空旋转浓缩至200 mL，加入4 g活性炭，匀速搅拌10 min，然后在80℃保温20 min。溶液用滤纸过滤，并用蒸馏水反复洗涤滤液两次，合并滤液60℃真空旋转浓缩至60 mL，浓缩的溶液加入140 mL无水乙醇脱盐，室温下处理1 h。溶液过滤，60℃真空旋转蒸发除去乙醇，蒸馏水定容至100 mL[16]。

1.3.3发酵提取液中γ-氨基丁酸的含量测定

发酵提取液中γ-氨基丁酸含量的测定采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生高效液相色谱法，具体色谱条件如下：

色谱仪：使用D-2000 Elite（Hitachi）系列高效液相色谱仪，紫外检测器；

色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；

色谱条件：流动相：20%乙腈-20%甲醇-60%醋酸钠缓冲液（pH7.2：NaAc·3H2O 1.6 g，色谱纯甲醇200 mL，色谱纯乙腈200 mL，加超纯去离子水至1 L），柱温40℃，检测波长338 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。

1.3.4阳离子交换树脂的选择

本研究纯化γ-氨基丁酸采用目前精制氨基酸应用最广泛的方法——离子交换层析法，采用阳离子交换树脂作为分离介质[17]。

表1　3种强酸性阳离子交换树脂的基本性能指标Table 1　The basic performance indexs of the three strongly acidic resin

1.3.5阳离子交换树脂的制备[18]

将150 mL树脂置于洁净的烧杯中，用温水反复漂洗，直至排水清晰为止，用蒸馏水浸泡树脂12 h，然后抽干水分，重复上述过程2次，使树脂充分膨胀。用300 mL 1 mol/L的盐酸溶液浸泡树脂2 h～4 h，并不时搅拌。然后用蒸馏水洗涤，至吸出液的pH接近4.0。随后用300 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液浸泡6 h～12 h，并用蒸馏水冲洗至pH为略碱性，再用300 mL 1 mol/L的盐酸溶液处理，使树脂变为氢型，最后用蒸馏水洗至pH为4.0，并且无氯离子存在。

1.3.6静态吸附试验[19]

1.3.6.1吸附量的测定

准确称取已经过预处理的湿树脂3.0 g，布式漏斗抽滤吸干表面水分，装入250 mL锥形瓶中，准确加入一定浓度的米糠发酵提取液100 mL，调节pH为3.0，瓶口密封，在温度为25℃，摇床转速为130 r/min条件下振荡24 h，使发酵液中的γ-氨基丁酸充分吸附在树脂，过滤，测定溶液中γ-氨基丁酸的浓度，同时测定初始发酵提取液中γ-氨基丁酸的浓度，按下式计算树脂在相同条件下对发酵提取液中γ-氨基丁酸的吸附量。

1.3.6.2解吸率的测定

准确称取按照上述方法充分吸附好的树脂3.0 g，布式漏斗抽滤吸干表面水分，装入250 mL锥形瓶中，准确加入浓度为1 mol/L的氨水溶液100 mL，瓶口密封，在温度为25℃，摇床转速为130 r/min条件下振荡24 h，过滤，高效液相色谱法测定滤液中γ-氨基丁酸的浓度，按照下式计算树脂的解吸率。

1.3.6.3吸附时间对树脂吸附容量的影响

准确称取732阳离子交换树脂5.0 g，吸干树脂表面的水分，置于250 mL锥形瓶中，加入已知质量浓度的米糠发酵提取液150 mL，密封瓶口，在温度为25℃，摇床转速为130 r/min条件的摇床培养箱中振荡，分别在吸附时间为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h时测定发酵提取液中γ-氨基丁酸的浓度，测定3次取平均值。

1.3.6.4上样液pH对树脂吸附容量的影响

取经过预处理的发酵物提取液，分别调pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，取适量经预处理的树脂与发酵物提取液混合，100 r/min振荡24 h，使之完全吸附，高效液相色谱法测定吸附后提取液的γ-氨基丁酸含量，测定吸附量。

1.3.7动态吸附实验[20]

1.3.7.1上样浓度对树脂动态吸附的影响

取适量预处理好的阳离子交换树脂，布式漏斗抽滤除去表面水分，装入玻璃层析柱中，分别取稀释至浓度为0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL的γ-氨基丁酸发酵提取液100 mL，以1 mL/min的上样流速上样，收集流出液，旋转蒸发浓缩并稀释定容至100 mL，测定流出液中γ-氨基丁酸的浓度，计算阳离子交换树脂的吸附量。

1.3.7.2上样流速对树脂动态吸附的影响

取适量预处理好的阳离子交换树脂，布式漏斗抽滤除去表面水分，装入玻璃层析柱中，分别取稀释至浓度为2 mg/mL的γ-氨基丁酸发酵提取液100 mL，以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min的上样流速上样，收集流出液，旋转蒸发浓缩并稀释定容至100 mL，测定流出液中γ-氨基丁酸的浓度，计算阳离子交换树脂的吸附量。

1.3.8洗脱实验

当洗脱液的酸碱度不同时，γ-氨基丁酸的洗脱效果也不尽相同，将上述吸附好的阳离子交换树脂层析柱分别加入pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的洗脱剂100 mL，收集流出液，旋转蒸发浓缩并稀释定容至100 mL，测定流出液中γ-氨基丁酸的浓度，计算阳离子交换树脂的吸附量。

2　结果与讨论

2.1γ-氨基丁酸标准曲线图

γ-氨基丁酸标准曲线图见图1。

图1　γ-氨基丁酸标准曲线图Fig.1　Standard curve of GABA

将配制的不同浓度γ-氨基丁酸标准系列溶液衍生后分别吸取20 μL进样，按选定的色谱条件进行分析，每个标品进样3次，峰面积取平均值。在一定浓度范围内，γ-氨基丁酸的紫外吸收（可转变为某时刻出峰的峰面积大小）与γ-氨基丁酸浓度呈线性关系。以γ-氨基丁酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。通过回归方程计算求得回归方程y=0.022 8x-0.369，相关系数R2=0.996 4，工作曲线如图1所示。

2.2超声波辅助提取条件优化

超声波辅助提取目前广泛的应用于各种生物活性物质的分离提取和检测前处理中，具有操作步骤少，提取效果好，节省能源，试验时间短等众多优点，应用前景广阔。根据γ-氨基丁酸易溶于水的特性，采用蒸馏水作为提取溶剂，使用超声波提取提取仪提高提取效率，研究料液比、超声时间、提取次数对米糠发酵物中GABA含量的影响。料液比对发酵产物中GABA提取效果的影响见图2。

由图2的趋势可以看出，随着料液比的增加，米糠发酵提取液中γ-氨基丁酸的含量迅速增加，当料液比达到1∶10（g/mL）时，提取液中γ-氨基丁酸含量的增速减缓并逐渐趋于稳定。当料液比过低时，米糠发酵物不能与提取液充分接触，并且超声提取的原理就是利用提取过程中水分子与物料颗粒之间的作用力来提高提取效率的，因此料液比增高有助于增强提取效果。然而如果料液比过高，提取液体积过大，增加提取量的效果相对不明显，不利于γ-氨基丁酸提取液的后续浓缩和纯化。综合考虑成本和其他因素，确定最佳提取料液比为1∶10（g/mL）。超声时间对发酵产物中GABA提取效果的影响见图3。

图3　超声时间对发酵产物中GABA提取效果的影响Fig.3　Effect of the ultrasonic timeon GABA content in fermented product

由图3可知，提取液中γ-氨基丁酸的含量随着提取时间的延长当而呈现增加趋势，当超声时间达到30 min时达到最大提取；当超声时间小于40 min时，发酵物提取液中γ-氨基丁酸的含量趋于稳定，当提取时间大于40 min时，γ-氨基丁酸的含量呈现缓慢的下降趋势，这可能是由于超声时间过长，超声仪中提取液温度上升，加之超声作用，不利于提取液中γ-氨基丁酸的稳定，因此选取超声辅助提取时间为30 min。与传统的热水浸提法相比，超声波辅助提取具有较大的优势，这一提取过程中机械作用和空化作用相互协同[21]，增大了水分子和物料分子之间的运动频率和速度，并且增强了溶剂穿透能力，可以大大地缩短提取时间，从而提高了γ-氨基丁酸的溶出速度和含量。

当进行固体的液体超声提取时，为了提高提取效率，一般需要进行分步提取。提取次数对发酵产物中GABA提取效果的影响见图4。

图4　提取次数对发酵产物中GABA提取效果的影响Fig.4　Effect of the extraction timeson GABA content in fermented product

由图4可以看出，发酵物提取液中γ-氨基丁酸的含量随着提取次数的增加呈现先增大后趋于稳定的趋势。提取次数对发酵物提取液中γ-氨基丁酸含量的影响显著，前3次提取效果比较明显，当继续进行第4次、第5次提取时，γ-氨基丁酸的含量变化不大，说明此时已经没有更多的γ-氨基丁酸转移到提取液中，提取已经基本完全。而且提取次数过多不仅会提高试验成本，而且会造成得到的提取液体积过大，不利于γ-氨基丁酸提取液的后续浓缩和纯化。因此选择提取次数3次最为合适。

2.3离子交换层析对γ-氨基丁酸的纯化

2.3.1树脂的选取和制备

根据离子交换层析的主要原理和有关发酵液中γ-氨基丁酸的纯化相关文献可知[22]，与其他类型的树脂相比，强酸型阳离子交换树脂对γ-氨基丁酸的静态交换容量较大，因此本试验选取了732型、734型和D001型3种阳离子交换树脂作为研究对象。三种阳离子交换树脂的静态吸附容量见图5。

图5　三种阳离子交换树脂的静态吸附容量Fig.5　Static capacity of three kinds of ion-exchange resins

由图5可以看出，3种阳离子交换树脂的静态吸附容量都比较大，均超过了20 mgGABA/g树脂，其中734型树脂吸附容量较低，732型和D001型阳离子交换树脂吸附容量较高。这两种树脂中732型属于凝胶型树脂，D001型属于大孔型树脂，一般来说大孔型树脂具有强度大，离子扩散速度快，使用时效率高，所需处理时间缩短等特点，但吸附量往往不如凝胶型树脂。732型凝胶树脂具有价格低廉，吸附量大，吸附速度快等特点，因此选取732型强酸性阳离子交换树脂进行后续试验。李向平等[22]的研究比较001×7、001×4、D001、S-9、S604、201×7、117、D113和D204等7种不同类型的树脂对γ-氨基丁酸的静态吸附容量，研究发现弱酸型阳离子交换树脂和强碱型阴离子交换树脂的交换容量比较小，而强酸型阳离子交换树脂的静态吸附容量普遍较大，与本研究的结论一致。该研究测得交换容量达到1.6 mmol/g树脂以上，比本研究测定得到的交换容量稍高，且D001型树脂的交换容量比732型树脂交换容量大，与本研究略有不同。分析原因可能在其测定γ-氨基丁酸的静态吸附容量是以γ-氨基丁酸标准溶液作为吸附溶液，而本试验是采用预处理后的米糠发酵物提取液，这两种试验方法各有千秋，采用γ-氨基丁酸标准溶液在测定吸附前后γ-氨基丁酸浓度变化时，结果较为准确，计算得到的静态吸附容量更精确，但并不能完全代表树脂对实际发酵液的吸附情况；本研究采用预处理后的米糠发酵物提取液进行试验，测定吸附前后γ-氨基丁酸浓度变化不如前者精确，但更能够预测出不同类型树脂在特定发酵提取液中的吸附容量，因为发酵提取液中还可能存在其他杂质氨基酸，可能会对阳离子交换树脂对γ-氨基丁酸的吸附造成竞争，这也是本研究测定吸附容量略低的原因。

2.3.2732型树脂吸附量和解析率的测定

由2.3.1试验结果，可以得到732型阳离子交换树脂的吸附量为34.3 mg/g树脂。用100 mL NH3·H2O解吸3.0 g充分吸附了GABA的树脂，25℃振荡处理24 h后过滤，测定滤液中GABA浓度，根据公式计算得出阳离子交换树脂的解吸率为98.7%。黄怀生等[23]使用不同种类的阳离子交换树脂分离纯化茶叶中γ-氨基丁酸，在初始浓度1.608 mg/mL的条件下，测定吸附平衡后，树脂的吸附量为42.9 mg/g，使用2/4NH3· H2O在室温下进行解吸，测得解吸率为98.08%，与本研究结果基本一致。

2.3.3静态吸附动力学试验结果

吸附时间与静态吸附量的关系试验结果如图6所示。

图6　吸附时间与静态吸附量的关系Fig.6　Effect of absorption time on static capacityof resins

由图6可以看出，随着吸附时间的增加，吸附量先迅速增大，之后呈稳定趋势。阳离子交换树脂在吸附开始的0.5 h之内的吸附速度非常快，基本己经达到其吸附总量的70%，在2 h以后，吸附量基本趋于稳定。732树脂的吸附速度很快，并且吸附量也较大，2 h左右即可基本实现完全吸附。这与文献[23]中732阳离子交换树脂在5 h后吸附已经超过了90%的研究结果基本一致。综合吸附量、解吸率和吸附速率这3个因素考虑，可以看出732树脂是比较适合分离纯化米糠发酵提取液中的γ-氨基丁酸的。上样液pH对树脂GABA吸附量的影响见图7。

图7　上样液pH对树脂GABA吸附量的影响Fig.7　Effect of pH on static capacityof resins

从图7中可以看出，交换树脂的γ-氨基丁酸吸附量随着上样液pH的变化呈现剧烈的变化，吸附量首先快速增大，并且在pH为3.0时达到最大，之后呈现下降趋势，当提取液的pH下降到7.0时，树脂的γ-氨基丁酸吸附量已经下降到5 mgGABA/g树脂以下。由此可知酸性提取液有助于树脂的良好吸附，这是因为GABA本身就是一种氨基酸，同时带有碱性基团，因此在酸性环境中氨基易结合一个质子而成阳离子状态，容易被树脂吸附[24]。由上图可知，要达到较好的吸附效果，应当使上样液pH控制在3.0左右。

2.3.4离子交换树脂吸附动力学试验结果

离子交换树脂吸附动力学试验结果见图8。

图8　上样液GABA质量浓度对交换树脂动态吸附的影响Fig.8　Effect of GABA mass concentration on static capacityof resins

由图8可知，交换树脂动态吸附量随着提取液质量浓度的增大呈上升趋势，当γ-氨基丁酸质量浓度在2 mg/mL以下时，吸附量的上升速度很快；当提取液的质量浓度大于2 mg/mL时，吸附量的增速减缓并趋于稳定。虽然提取液的质量浓度越大，树脂吸附量随之增大，但提取液质量浓度过大，不仅会增大提取液预处理时旋转蒸发时的工作量，而且不利于控制成本，因此本研究选择上样液质量浓度控制在2 mg/mL较为合适。上样液流速对交换树脂动态吸附的影响见图9。

图9　上样液流速对交换树脂动态吸附的影响Fig.9　Effect of flow velocities on static capacityof resins

由图9可知，交换树脂动态吸附量随着流速的增加而减小，流速为1 mL/min的时候吸附量为最佳，但是如果上样流速过低导致实验周期延长，因此综合考虑试验便捷性和吸附量随上样流速的降低程度，本研究选择上样流速为2 mL/min。

2.3.5洗脱实验结果

不同pH的洗脱液对GABA的洗脱程度不同，将上述吸附好的树脂层析柱分别加入pH为5.0、6.0、7.0 的100 mL柠檬酸缓冲液和pH为8.0、9.0、10.0和11.0 的100 mL NH3·H2O进行洗脱。碱性条件下GABA中的羧基电离出一个质子而带负电荷，呈阴离子状态，从而使阳离子交换树脂的吸附量大大降低，以此达到解吸附的目的。洗脱液pH对洗脱效果的影响见图10。

图1　0　洗脱液pH对洗脱效果的影响Fig.10　Effect of eluent pH on the degree of elution

由试验可以看出，当洗脱液为酸性时，洗脱液中几乎检测不到GABA的存在，当洗脱液的pH逐渐上升到碱性时，洗脱液中的GABA浓度开始上升，在pH=8.0～10.0时，洗脱效果最佳。

取经过预处理的发酵物粗提液200 mL，调节其γ-氨基丁酸质量浓度约为2.0 mg/mL，调pH为3.0，上样流速2 mL/min，将粗提液匀速上样到装有阳离子交换树脂的层析柱上，上样完成后用300mL蒸馏水以1mL/min的流速冲洗，再用150mL0.1mol/L的氨水以1mL/min的流速冲洗，以便除去其他吸附在层析柱中可在酸性和中性洗脱剂中洗脱的杂质氨基酸。冲洗完成后用1 mol/L氨水溶液作为洗脱剂，2 mL/min的流速匀速通过层析柱，并实时测定洗脱液的pH，收集pH 8～11的洗脱液，分装各小试管，分别测定其γ-氨基丁酸含量，取γ-氨基丁酸含量大于60%的组分。洗脱过程中，使用蒸馏水和0.1 mol/L的氨水可以将提取液中的非特异性杂质除去。为了把γ-氨基丁酸从树脂中解吸出来，需要减弱带电粒子间的相互作用力，这通常是通过增加离子强度或增大pH从而降低电荷作用力或改变γ-氨基丁酸的极性来实现的[16]。如果使用第一种方法洗脱，那么就会引入新的无机盐到γ-氨基丁酸提取液中，从而偏离了获得高纯度γ-氨基丁酸的目的。作为有效且价格低廉的试剂，氨水可以很容易的增大体系的pH，并且很容易从溶液中去除，因此使用氨水作为洗脱剂从树脂中洗脱γ-氨基丁酸。各管洗脱液体积及γ-氨基丁酸含量见表2。

表2　各管洗脱液体积及γ-氨基丁酸含量Table 2　The valume and GABA content of different collect liquid

由表2可知，收集γ-氨基丁酸含量大于60%的馏分，混合并旋转蒸发除去氨水，待旋蒸体积不变时，用蒸馏水将浓缩液定容至10 rnL，测得其γ-氨基丁酸的浓度为17.9 mg/rnL，纯化提取物中γ-氨基丁酸的纯度为73.1%，由此计算得到本研究中离子交换层析法纯化γ-氨基丁酸的得率为44.9%。提取液纯化前的液相色谱图见图11和图12。

图1　1　提取液纯化前的液相色谱图Fig.11　High performance liquid chromatogram of fermented liquid before extraction and purification

由图12可以看出，经过纯化后γ-氨基丁酸的特征色谱峰十分明显，色谱图中杂峰的干扰较之纯化前有了明显的减少，说明离子交换层析对发酵物提取液中γ-氨基丁酸的纯化有一定的效果。同时我们也注意到，在5.5 min处有一较为明显的杂峰干扰，这可能是发酵物提取液中存在的谷氨酸没有完全除去，后续实验我们会继续优化纯化条件，改进实验方法以得到更好的试验结果。

图1　2　提取液纯化后的液相色谱图Fig.12　High performance liquid chromatogram of fermented liquid after extraction and purification

3　结论

本研究采用超声波辅助提取对发酵米糠进行初步提取，然后采用离子交换层析法进行纯化，提取液经过离心、脱色、脱盐等预处理，通过静态吸附试验和吸附动力学实验确定离子交换层析的最适条件。结果表明，选取732型强酸性阳离子交换树脂、上样pH为3.0、上样液浓度2 mg/mL，流速2 mL/min，洗脱液pH 8.0～10.0，收集馏分，测得其γ-氨基丁酸的纯度为73%，计算得提取纯化γ-氨基丁酸的得率为44.9%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.016

收稿日期：2015-07-05

作者简介：王姣斐（1989—），女（汉），助教，硕士，研究方向：饮食营养与食品卫生，食品加工。

*通信作者：陈野（1968—），男（汉），教授，博士，研究方向：农产品加工及农产品副产物生物学转化技术。

Ion-exchange Chromawgraphy Separeted and Purified γ-aminobutyric Acid from Fermentation Rice Bran

WANG Jiao-fei1，CHEN Ye2，*，CHEN Yuan-ping1
（1.Hangzhou Sergeant School of CAPF，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Rice Bran fermented by Aspergillus oryzae was as the object of study，the methods of separation and purification of gamma aminobutyric acid of fermented rice bran was researched.The ultrasonic extraction was used to separation GABA from rice bran and GABA purification was conducted by successive centrifugation，filtration，decoloration，desalination and ion-exchange chromatography（IEC）.Results showed that the selected 732 strong acid cation exchange resin，the sample pH value was 3 and sample concentration，2 mg/mL，flow rate of 2 mL/min，eluent pH 8-10 fractions were collected.The recovery rate for the wholepurification process was about 44.9%.The purified product was characterized by HPLC，and its purity reached about 73%.

Key words：fermantation rice bran；γ-Aminobutyric acid；Ion-exchange chromatography；separate and purify