椆树桑寄生多糖提取工艺优化

廖日权，钟秋平，许兰仙（.钦州学院海洋学院，广西钦州535000；.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川7500）

椆树桑寄生多糖提取工艺优化

廖日权1，钟秋平1，许兰仙2
（1.钦州学院海洋学院，广西钦州535000；2.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021）

摘要：以椆树桑寄生树叶为原料，对植物多糖提取的影响因素及工艺进行优化研究。采用热水浸提方法，分析提取温度、时间、料液比和醇降浓度对提取椆树桑寄生植物多糖的影响。采用硫酸-苯酚法测定椆树桑寄生植物多糖，根据L9（34）正交试验优化确定椆树桑寄生多糖最优提取条件为：提取温度为80℃、料液比为1∶20（g/mL）、提取时间为2.0 h，乙醇醇降浓度为70%。在此条件下，椆树桑寄生多糖提取率为1.7%。

关键词：椆树桑寄生；多糖；提取工艺；正交试验

椆树桑寄生（Loranthus delavayiVan TieghDanser）又名广寄生、寄生茶，为桑寄生科钝果寄生属植物，可寄生于海拔500 m～3 000 m山谷、山地常绿阔叶林中，常寄生于壳斗科植物上。我国主要分布于西藏（察隅）、云南、广西、福建等地[1]。该药材味苦、甘，性微温，功效主治为祛风湿、补肝肾、续骨，主治风湿痹证、腰膝疼痛、骨折[2]。目前，国内外学者从椆树桑寄生科植物的提取物中分离到多种化学成分，研究表明该植物多种成分具有抗肿瘤等活性[3-6]。

同时，许多植物多糖具有生物活性，它们具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒、保护肝脏等保健作用[7-10]。但到目前为止，通过查阅文献发现国内外尚没有学者对椆树桑寄生植物多糖提取工艺进行研究。因此本研究以广西河池地区的椆树桑寄生树叶为研究对象，以水溶性多糖得率为指标，对椆树桑寄生植物多糖的提取工艺进行了单因素试验和正交试验研究，探讨其植物多糖提取最佳工艺条件，为开发广西的椆树桑寄生资源提供科学参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

椆树桑寄生植物1 000 g，采摘于广西河池市，由钦州学院钟秋平副教授鉴定。

1.1.2试剂

葡萄糖、浓硫酸、苯酚、95%乙醇、氯仿、正丁醇，所有试剂均为国产分析纯。

1.1.3仪器

BL610型电子天平：上海上天精密仪器有限公司；可见分光光度计：北京普析通用仪器设备有限责任公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室开发有限公司；电热鼓风干燥箱：上海智城分析仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖的制备

准确称取椆树桑寄生树叶干粉100 g，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水1 000 mL，80℃水浴浸提120 min，抽滤；滤渣重复提取两次，合并3次滤液，过滤，沉淀，4 000 r/min离心10 min，在旋转蒸发仪上进行真空浓缩，然后向浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇，沉淀10 h，再3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，有机溶剂洗涤沉淀两次，真空干燥沉淀物，得椆树桑寄生粗多糖。

将干燥的椆树桑寄生粗多糖用蒸馏水溶解，活性炭75℃水浴100 min，间歇搅拌，4 000 r/min离心10 min，上清液中加入2.4倍体积的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），振荡后静置30 min，4 000 r/min离心10min，取上清液，减压蒸馏浓缩，95%乙醇醇析，提取到椆树桑寄生多糖沉淀，用无水乙醇反复洗涤2次～3次，真空干燥后得精制树桑寄生多糖多糖备用。

1.2.2苯酚-硫酸法测定多糖含量

1.2.2.1测定波长的确定

配制一定浓度的椆树桑寄生植物多糖溶液和葡萄糖标准溶液，精密量取1.0 mL于石英比色皿中，根据多糖与苯酚-浓硫酸试剂发生特异性反应[10]，以等量的蒸馏水作空白，在UV-3200紫外可见分光光度计上从400 nm～700 nm进行扫描，确定椆树桑寄生植物多糖和葡萄糖的最大吸收波长为490 nm。

1.2.2.2标准曲线的制作

将葡萄糖配制成0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL系列标准溶液，采用苯酚-硫酸法于490 nm处测量吸光度。以葡萄糖浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=3.538 9C-0.006 2（R2=0.999 3）。

1.2.2.3换算因子的测定

准确称取干燥恒重椆树桑寄生多糖50.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，作为多糖储备液。吸取0.2 mL，加水至1 mL。按1.2.2.2步骤测定吸光值，重复3次。按照如下公式计算换算因子f。

式中：W为椆树桑寄生多糖的质量，mg；C为椆树桑寄生多糖溶液中葡萄糖浓度，（mg/mL）；D为稀释因子，mL。取3次测量平均值，计算得f=2.35。

1.2.2.4苯酚-硫酸法计算多糖提取率

按照1.2.6中步骤，将沉淀的多糖用蒸馏水溶解后定容，按1.2.2.2步骤测其吸光值，根据标准曲线与换算因子计算椆树桑寄生叶多糖提取率。

椆树桑寄生多糖提取率（%）=C×D f/W×100

式中：C为椆树桑寄生多糖溶液中葡萄糖浓度，（mg/mL）；D为稀释因子，mL；f为换算因子；W为椆树桑寄生样品质量，mg。

1.2.4影响多糖提取效果的单因素试验

准确称取椆树桑寄生叶干粉1.00 g，置于比色管中，加入一定体积蒸馏水，水浴加热浸提一定时间，提取液减压过滤，滤渣重复浸提步骤3次；合并滤液，减压蒸馏，浓缩液醇沉得多糖，多糖经蒸馏水溶解、定容，测定椆树桑寄生多糖含量并计算提取率。分别以提取温度、提取时间、料液比和醇降浓度4个因素为对象，考察其对椆树桑寄生多糖提取率的影响。

1.2.5椆树桑寄生多糖提取的正交试验

在单因素试验的基础上，以提取温度、提取时间、料液比和乙醇浓度四因素三水平进行L9（34）正交试验，优化多糖的提取工艺。水平表见表1。

表1　椆树桑寄生植物多糖提取工艺优化正交试验因素水平表Table 1　Factors and levels of orthofonal test of polysaccharide of Loranthus delavayiVan TieghDanser

1.2.6验证试验

为了进一步考察优选工艺的可靠性和稳定性，精密称取1.0 g椆树桑寄生叶粉末，在1.2.5确定的工艺条件下进行3次试验，验证所提取条件优化的稳定性。

2　结果

2.1单因素的优化

2.1.1醇降浓度对多糖提取效果的影响

醇降浓度对多糖提取效果的影响见图1所示。

图1　乙醇浓度对多糖提取率的影响Fig.1　The effect of alcohol concentration on polysaccharide extraction rate

由图1可知，随着乙醇浓度的增大，多糖提取率增大，浓度在70%时，提取效果最好；随后，多糖提取率随乙醇浓度的增加，多糖提取率下降。

2.1.2料液比对多糖提取效果的影响

料液比对多糖提取效果的影响见图2所示。

由图2可知，随着液料比减小，多糖提取率首先增加，在液料比为1∶20（g/mL）时，多糖提取率最大；过了1∶20（g/mL）多糖提取率呈下降的趋势。

2.1.3提取温度对多糖提取效果的影响

提取温度对多糖提取效果的影响见图3所示。

图2　料液比对多糖提取率的影响Fig.2　The effect of solid-liquid ratioe on polysaccharide extraction rate

图3　提取温度对多糖提取率的影响Fig.3　The effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

由图3可知，随着提取温度的提高多糖提取率增加，温度在80℃时，提取效果最好；随后，多糖提取率随提取温度的升高而降低。

2.1.4提取时间对多糖提取效果的影响

提取时间对多糖提取效果的影响见图4所示。

图4　提取时间对多糖提取率的影响Fig.4　The effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

图4可知，多糖提取率随提取时间的延长而升高，当时间超过2 h后，提取率呈下降趋势。试验表明2 h时为最佳提取时间，提取效果最好。

2.2正交试验结果

根据单因素试验结果，以提取温度、提取时间、料液比和醇降浓度为考察因素，各取3个水平，设计正交试验表（表1），对椆树桑寄生多糖提取工艺进行优化，优化结果见表2。

表2　椆树桑寄生多糖提取工艺优化L9（34）正交试验设计及结果Table 2　The results of orthofonal test on polysaccharide of Loranthus delavayiVan TieghDanser

由极差R值可知，各考察因素对椆树桑寄生多糖提取效果的影响程度为提取温度＞料液比＞提取时间＞醇降浓度。从K值来看，A因素列极差K2＞K3＞K1，B因素列极差K2＞K3＞K1，C因素列极差K2＞K1＞K3，D因素列极差K1＞K3＞K2，因此确定椆树桑寄生植物多糖法水提醇降法最佳提取工艺条件为：A2B2C2D1，即提取温度80℃，提取时间2.0 h，料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度为70%。

2.3验证试验结果

为了进一步考察优选工艺的可靠性和稳定性，精密称取1.0 g椆树桑寄生植物粉末，在上述确定的最优工艺条件下进行3次平行提取试验，测提取多糖提取率分别为1.66%、1.73%和1.72%，平均值约为1.7%。试验表明，此工艺稳定、重复性较好。

3　结论

利用水提醇降法提取多糖具有能耗低、省时、不破坏有效成分等优点，该工艺合理、成熟，有较高的开发价值。通过单因素实验以及正交试验，试验提取出各因素对椆树桑寄生多糖提取效果的影响程度为提取温度＞料液比＞提取时间＞醇降浓度。确定椆树桑寄生植物多糖法水提醇降法提取多糖最佳工艺条件为：提取温度80℃，提取时间2 h，料液比1∶20（g/mL），醇降浓度为70%。

参考文献：

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1988:86-58

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999:599-600

[3]Shahid Iqbal,Saba Haleem,Mubeena Akhtar,et al.Efficiency of pomegranate peel extracts in stabilization of sunflower oil under accelerated conditions[J].Food Research International,2008,41(2): 194-200

[4]苏现义.植物多糖降血糖作用研究进展[J].食品与药品,2014,16 (4):VII-VIII

[5]孙艳秋.桑寄生原植物的本草考证[J].中医药研究,1999(6):49-50

[6]朱晓薇,刘一兵.桑寄生科植物的化学成分与抗肿瘤作用[J].国外医药(植物药分册),2001(4):142-145

[7]Zee Cheng T.Anti cancer research on Loranthaceae plants[J].Drugs of the Future,1997(22):519-530

[8]杨倩,桑寄生贮藏和制作工艺对药效的影响[J].当代医学,2012 (35):143-144

[9]郝利民,张建春,鲁吉珂,等.云南种植玛咖中多糖提取工艺的优化研究[J].食品工业科技,2013,34(3):262-264

[10]王蓓.袖珍菇多糖提取的研究[J].食品研究与开发,2014,35(2): 29-34

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.012

收稿日期：2014-11-20

基金项目：钦州学院科研项目（2013XJKY-10B）；广西高校科学技术研究项目（KY2015LX537）

作者简介：廖日权（1982—），男（汉），实验师，硕士研究生，主要从事海洋药物及海洋环境化学研究。

The Extraction Process of Polysaccharide from Loranthus delavayiVan Tiegh

LIAO Ri-quan1，ZHONG Qiu-ping1，XU Lan-xian2
（1.Marine School of Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China；2.School of Biological Sciences and Engineering of Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Abstract：The polysaccharide was extracted from the leaf of Loranthus delavayiVan TieghDanserp in Guangxi，and the extraction process was studied by single factor and orthogonal experiment.With water as extraction solvent，the effect of extraction temperature，extraction time，solid-liquid ratio and alcohol concentration on the yield of polysaccharide were optimized with single factor test followed by four factor-four level orthogonal experiment.The result showed that the optimal extraction conditions of polysaccharide were：the extraction temperature was 80℃，the solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL），the extraction time was 2 h and the alcohol concentration was 70%.Under these conditions the polysaccharide extraction yield was 1.7%.

Key words：Loranthus delavayiVan Tiegh，polysaccharide，extraction process，orthogonal experiment