弓形虫棒状体ROP16基因转染RAW 264.7的实验研究

谢园园，徐元宏，闻慧琴，3，王书书，李源玲，储德勇，沈继龙

◇基础医学研究◇

弓形虫棒状体ROP16基因转染RAW 264.7的实验研究

谢园园1，徐元宏2，闻慧琴2，3，王书书1，李源玲1，储德勇1，沈继龙1

摘要目的比较目前常用的5种基因导入技术将弓形虫棒状体ROP16基因导入RAW264．7，选择合适的方法提高转染效率。方法以绿色荧光蛋白pEGFP-ROP16融合表达构建质粒，采用LipofectamineⓇ3000、Attractene、FugeneⓇHD转染试剂以及电穿孔转染和慢病毒载体感染RAW264．7，利用荧光显微镜和流式细胞仪观察目的基因的表达、细胞生长状态并分析转染效率，从而确定最佳的基因导入途径。结果上述质粒载体对RAW264．7的转染效率依次为电转法＞FugeneⓇHD＞LipofectamineⓇ3000＞Attractene。但是电转法转染后细胞死亡率较高，细胞贴壁不牢或死亡；而慢病毒感染效率可达61．2%，细胞生长状态佳，显著优于质粒载体（P ＜0．05）。慢病毒组显著优于4个质粒组（P＜0．05）。结论慢病毒感染可将弓形虫棒状体ROP16成功转入RAW264．7，具有较高的转染效率，效果显著优于质粒载体，目的基因在细胞内获得高效表达。为弓形虫ROP16的功能研究提供了重要基础。

关键词ROP16基因；RAW264．7；慢病毒感染

弓形虫广泛寄生于温血动物的有核细胞内，能够侵入单核巨噬细胞并在细胞内增殖。棒状体蛋白16（rhoptry protein 16，ROP16）是由虫体棒状体分泌的重要毒力相关因子，具有激酶样活性，可以直接磷酸化Stat3和Stat6［1－2］，上调白介素（interleukin，IL）-4和下调IL-12的表达，诱导替代活化型巨噬细胞（alternatively activated amcrophage，M2）／辅助性T细胞2（helper T cell2，Th2）的免疫偏移或极化。研究［3－4］表明，ROP16蛋白可促进M2的活化及Th2应答。巨噬细胞在机体中分布广泛并具有十分活跃的生物学功能［5］。目前对于巨噬细胞的研究［6］主要着重于其异质性，在不同的微环境条件下可向经典活化型或M2偏移或者极化，各自发挥不同的细胞内杀伤、炎症反应、免疫调节和组织重构等作用。目前研究［7－8］的细胞载入技术主要有非病毒导入系统（磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法等）和病毒导入系统（病毒载体）。但各有优缺点，且大都操作较复杂，转染效率较低，设备要求较高。该研究分别采用ROP16重组质粒和重组慢病毒将目的基因导入小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264．7，采用LipofectamineⓇ3000、Attractene、FugeneⓇHD转染试剂，及电穿孔转染法、慢病毒感染法转染RAW264．7，比较5种基因导入方法的转染效率，为深入研究ROP16的结构及其功能奠定基础。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞与主要试剂

RAW 264．7巨噬细胞系购自上海中科院研究所；LipofectamineⓇ3000转染试剂（美国Invitrogen公司）；Attractene转染试剂（德国QIAGEN公司）；FugeneⓇHD转染试剂（美国Promega公司）；高糖DMEM培养基、胎牛血清（加拿大Wisent公司）；OptiMEM培养基（美国Gibco公司）；AxyPrep质粒大量提取试剂盒（美国Axygen公司）；胰酶和青霉素、链霉素（上海碧云天公司）；L-谷氨酰胺（北京Solarbio公司）；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司）；通用型内质网形态高质染色试剂盒（上海江莱公司）；DAPI染色试剂盒（上海贝博生物）；慢病毒试剂盒（上海吉凯基因公司）。

1．1．2主要仪器

电穿孔仪、2 mm石英电转杯（美国BioRad公司）；荧光显微镜IX71（日本Olympus公司）；流式细胞仪FACS Calibur（美国BD公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；激光共聚焦扫描显微镜SP5-DMI6000（德国LEICA公司）；超净工作台（苏州安泰公司）。

1．2方法

1．2．1质粒提取

弓形虫Wh3虫株ROP16基因

2015－05－26接收

科大学第一附属医院2检验科、3输血科，合肥230022

沈继龙，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：shenjilong53＠126．com；

储德勇，男，副教授，责任作者，E-mail：chudeyong＠126．com由安徽省病原生物学省级重点实验室扩增，总长2 124 bp。构建包含pE绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-ROP16的质粒并将其转化至大肠杆菌DH5a，单菌落增菌培养200 m l。用AxyPrep质粒大量提取试剂盒抽提和纯化质粒，溶解于灭菌超纯水，浓度调整为1 mg／ml，光密度（optical delnsity，OD）值OD260／OD280＝1．9。

1．2．2细胞复苏与传代

按常规方法复苏RAW264．7，培养于含15%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的DMEM培养液中，在5%CO2和37℃饱和湿度下传代培养。当细胞传3代，密度达到80%左右时，用0．25%胰酶消化并移入试管中，1 000 r／min离心5 min，弃上清液后，用1 m l上述培养液重悬计数。将细胞传至6孔板，1×106个／孔，用含10%FBS的DMEM培养液培养，待每孔内的细胞生长到70%～80%密度时开始转染。

1．2．3流式细胞仪检测转染效率

收集铺好在6孔板内的基因导入处理后的细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；用PBS洗涤细胞2次（2 000 r／min、离心5 min），收集1×105～5×105细胞；加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μl Annexin VFITC混匀后，4℃避光，反应15 min；用PBS洗涤细胞1次（2 000 r／min、离心5 min），500μl PBS重悬细胞；上流式细胞仪前5 min加入5μl PI，混匀；室温、避光、反应5～15 min，上机检测（1 h内，进行荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测）。因蛋白为GFP，调试好流式细胞仪后，得出图后将横坐标改为FITC通道，纵坐标改为直方图，可直接导出转染效率数值的流式图。

1.3Lipofectam ine3000转染法

按Lipofectamine 3000转染试剂盒操作步骤操作，转染前更换细胞液。取EP管2个，1号管OptiMEM培养液125μl 与5μl lip3000转染试剂混匀，2号管OptiMEM培养液125μl与10μl P3000和5μg质粒混匀，将2号管混匀后加入1号管，轻轻吹打混匀后室温孵育5 min，加入6孔板，5%CO2、37℃孵育箱孵育，24 h后观察细胞生长状态及荧光强弱，流式细胞仪检测转染效率。

1.4Attractene转染法

根据Attractene转染试剂说明书针对RAW 264．7的操作步骤，转染前更换细胞液。取EP管1个，加100μl OptiMEM培养液，加入1．2μg质粒，再加入转染试剂4．5μl，室温孵育10～15 min，加入6孔板内，5%CO2、37℃孵育箱孵育，24 h后观察细胞生长状态及荧光强弱，流式细胞仪检测转染效率。

1.5FugeneⓇHD转染法

按FugeneⓇHD转染试剂盒操作步骤，转染前无需换液。取EP管1个，加150μl OptiMEM培养液，先加入质粒3．3μg；再加入FugeneⓇHD转染试剂12μl，以得到适当的试剂与质粒的比例，轻柔混匀后，室温孵育10～15 min，加入6孔板，24 h后观察细胞生长状态及荧光强弱，流式细胞仪检测转染效率。

1．6电转染法

当细胞达70%～80%汇合时，胰酶消化后，加入培养基终止，和培养液一起转移至50 m l的一次性离心管，用血球计数器确定细胞密度，然后在4℃、1 500 r／min离心10 min，去除上清液。用电转染液cytomix重悬细胞，至3．75×107细胞／m l密度。添加200μl的细胞和10μg质粒于电转染杯中，在室温下孵育10 min，然后将电转染杯置于电转染仪中，设置电压与电容参数后电击。电击后迅速转移至含有6 m l培养液的培养瓶中，并在5%CO2、37℃孵育箱中孵育，24 h后观察细胞生长状态及荧光强弱，流式细胞仪检测转染效率。

1．7慢病毒感染法

1．7．1宿主细胞的准备

实验前保证细胞良好生长状态，实验前1 d接种5×103个细胞于96孔培养板中，所加培养液体积为每孔90μl，1次实验需要20个孔。进行病毒感染时细胞的汇合率约为50%左右。根据不同感染条件分为4组：①A组为正常培养基中直接加病毒感染；②B组为加病毒同时在培养基中添加5μg／m l的聚凝胺；③C组是将培养基更换成ENi．S．后加入病毒感染；④D组为在ENi．S．加病毒同时加5μg／ml的聚凝胺，每组均设有3个不同梯度的感染复数（multiplicity of infection，MOI）。在5%CO2、37℃孵育箱孵育8～12 h以后观察细胞状态，弃去细胞上清液，更换新鲜培养液。感染3 d后，观察细胞生长状态及荧光表达情况。

1．7．2细胞的感染

种植RAW264．7于6孔板中，当细胞汇合约50%时，正常培养液中直接加病毒感染，在5%CO2、37℃孵育箱孵育，每天观察细胞生长状态及荧光强弱，72 h后用流式细胞仪检测转染效率。

2　结果

正常的RAW264．7细胞形态为圆形或椭圆形，细胞在体外为激活状态时，可呈多突形，贴壁较为牢固（图1F）。

2.1Lipofectam ineⓇ3000转染法效果分析

6孔板内每孔各含LipofectamineⓇ3000 5μl、P3000 10 μl和质粒5μg，荧光显微镜下观察有GFP表达（图1A、2A），同样的转染方法重复操作3次。转染后细胞生长状态略欠佳，形态发生改变，少数细胞见有伪足，出现分化，流式细胞仪检测转染效率为6．83%（图3A）。

2.2Attractene转染法效果分析

6孔板内每孔各含Attractene转染试剂4．5μl，质粒1．2μg，荧光显微镜下观察有GFP表达（图1B、2B），同样的转染方法重复操作3次。转染后细胞生长状态略欠佳，形态发生改变，少量有伪足，出现分化，流式细胞仪检测转染效率为1．05%（图3B）。

2.3FugeneⓇHD转染法效果分析

FugeneⓇHD转染RAW264．7巨噬细胞，转染试剂量与质粒比例为3．5∶1，6孔板内每孔各含转染试剂12μl、质粒3．3μg，荧光显微镜下观察有GFP表达（图1C、2C），同样的转染方法重复操作3次。转染后细胞生长状态略欠佳，形态发生改变，少量有伪足，出现分化，流式细胞仪检测转染效率为10．1%（图3C）。

2．4电转染法效果分析

根据多次试验结果，死亡率均较高，电击后细胞状态较差。设置实验过程中相对较好的电转程序如下：电压200 V、电容960 μF、电阻无限大。荧光显微镜下观察有GFP表达（图1D、2D），同样的转染方法重复操作3次。但电转后发现细胞死亡率超过50%，大量细胞不贴壁，处于悬浮状态，并出现很多细胞碎片，贴壁细胞形态基本无变化。流式细胞仪检测转染效率为13．9%（图3D）。

2．5慢病毒感染法效果分析

根据预实验结果，加入病毒质粒后在不同的时间点观察荧光表达情况，显示72 h后细胞荧光表达较强（图1E、2E），并且细胞的生长状态佳，形态发生改变，一部分细胞伸出伪足，出现分化，流式细胞仪检测转染效率为61．2%（图3E）。慢病毒感染后的细胞，pEGFP-ROP16质粒在细胞内发出绿色荧光，通用型内质网形态高质染色试剂盒染色内质网发出红色光，DAPI染色试剂盒染色细胞核发出蓝色光（图4）。

2.65种基因导入方法转染RAW 264.7的效率比较

用上述常见的5种不同的基因导入方法处理RAW264．7，结果显示其转染效率各有不同。不同方法转染效率之间的比较见图5。经统计学分析，各组数据不属于正态分布，用非参数秩和检验，各组转染效率不全相同，具有统计学意义（P＜0．05）。再利用Mann-Whitney U法比较两两之间差异性，慢病毒转染法组与其他4组比较，差异有统计学意义（P＜0．05），故慢病毒感染法转染RAW264．7转染效率最高。

3　讨论

将外源基因导入真核细胞是研究目的基因功能的重要手段。对于不同大小的目的基因和不同类型的靶细胞应当选择不同的转染方法，以提高转染效率和转染后靶细胞的存活率，为后继实验提供最佳的实验条件。巨噬细胞在机体中分布广泛并具有十分活跃的生物学功能，通过基因导入改变巨噬细胞的功能进而调节疾病的免疫状态有望成为治疗某些疾病的新方法。

本实验目的基因片段为2 124 bp的弓形虫毒力相关因子ROP16，因GFP在哺乳动物细胞表达稳定，置荧光显微镜下易于检测，因此GFP是常用的标记分子［9］。将构建带有GFP-ROP16融合基因的质粒导入RAW264．7中。

LipofectamineⓇ3000属于阳离子脂质体转染试剂，其通过静电作用阳离子脂质体可介导反义分子探针吸附于带负电荷的靶细胞表面［10］，脂质复合物通过直接融合或内吞途径进入细胞，并贮存于核内体中，最终经转录和翻译，产生目的基因编码的蛋白。LipofectamineⓇ3000脂质体法是常用的转染方法，研究［11］报道其有转染效率高、安全、细胞毒性小、无免疫原性等优点。本实验中，对RAW264．7的质粒转染效率只有6．83%，可能的原因是：①可能与细胞的物种来源有关，细胞表面可能缺乏特异性受体［12］；②RAW264．7细胞是贴壁细胞，而脂质体转染方法对于悬浮细胞和贴壁细胞转染效率相差很大［13］。Attractene是一种非脂质体的脂类转染试剂，可转染几乎所有的贴壁细胞。其也高度适用于DNA和siRNA或miRNA模拟物／抑制剂的共转染，操作快速简便，对细胞毒性极低。但在本实验中其转染效率只有1．05%。FugeneⓇHD是一种新型非脂质体试剂，试剂中带正电荷的混合脂类分子与核酸中带负电荷的磷酸基团形成稳定的转染复合物。该复合物的正电荷与宿主细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合；或该复合物被细胞内吞而摄入。本实验中，该转染法的转染效率只有10．1%。电穿孔法广泛应用于基因克隆、外源基因的表达、基因定位、基因图谱的绘制等研究［14］。虽然有报道［15］电转染具有高效、安全等优点，但是电穿孔也存在细胞死亡率较高，引起细胞融合从而影响细胞性状和生长等问题［16］，本实验中效率仅为13．9%，宿主细胞死亡率超过50%，显然不适于后期实验的要求。

在基因转染载体中，慢病毒是具有良好前景的一种高效转染载体。慢病毒本身分子稳定，对靶细胞损害小，插入的外源性基因比较稳定，而且能把目的基因整合到细胞核内基因组中，所以通过加入适当浓度的嘌呤霉素可以进行药物筛选从而稳定传代，并能稳定表达。本实验慢病毒感染后，经证实其转染效率高达61．2%。激光共聚焦扫描图片显示弓形虫棒状蛋白ROP16基因导入RAW264．7细胞后主要定位于细胞核内。普通及荧光显微镜下可见基因导入后的靶细胞生长状态良好、形态发生改变并伸出伪足，推测宿主细胞可能被活化，这为后期研究ROP16基因功能以及巨噬细胞的极化提供了较为合适的实验条件。为进一步稳定转染其他具有筛选标记的目的基因到RAW264．7细胞中奠定了实验基础。

综上所述，与质粒载体的各种转染方法比较，采用慢病毒载体感染可将弓形虫ROP16成功转入RAW264．7巨噬细胞，并获得目的蛋白的高效表达，被转入的细胞生长状态良好。本研究不仅为ROP16诱导巨噬细胞偏移／极化的功能研究奠定了基础，也为获得其它目的基因在巨噬细胞内的过表达提供借鉴。

参考文献

［1］Spiegel R，Bach G，Sury V，etal．Amutation in the saposin A coding region of the prosaposin gene in an infant presenting as Krabbe disease：first report of saposin A deficiency in humans［J］．Mol Genet Metab，2005，84（2）：160－6．

［2］CampanaWM，O＇Brien JS，HiraiwaM，etal．Secretion of prosaposin，amultifunctional protein，by breast cancer cells［J］．Biochim Biophys Acta，1999，1427（3）：392－400．

［3］Jensen K D，Wang Y，Wojno E D，etal．Toxoplasma polymorphic effectors determinemacrophage polarization and intestinal inflammation［J］．Cell Host Microbe，2011，9（6）：472－83．

［4］Biswas S K，Mantovani A．Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets：cancer as a paradigm［J］．Nat Immunol，2010，11（10）：889－96．

［5］曹雪涛．免疫学前沿进展［M］．2版．北京：人民卫生出版社，2009：78．

［6］Gordon S．Alternative activation ofmacrophages［J］．Nat Rev Immunol，2003，3（1）：23－35．

［7］Sato M，Ito A，Akiyama H，et al．Effects of B-cell lymphoma 2 gene transfer tomyoblast cells on skeletalmuscle tissue formation usingmagnetic force-based tissue engineering［J］．Tissue Eng Part A，2013，19（1－2）：307－15．

［8］Sato M，Ito A，Kawabe Y，et al．Enhanced contractile force generation by artificial skeletal muscle tissues using IGF-1 gene-engineered myoblast cells［J］．JBiosci Bioeng，2011，112（3）：273－8．

［9］Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al．Green fluorescent protein as amarker for gene expression［J］．Science，1994，263（5148）：802 －5．

［10］王冰，张树彪，周集体，等．阳离子脂质体介导的基因转移机制［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15（8）：1459 －62．

［11］Dass C R，Walker T L，Burton M A．Liposomes containing cationic dimethyl dioctadecyl ammonium bromide：formulation，quality control，and lipofection efficiency［J］．Drug Deliv，2002，9（1）：11－8．

［12］Zuhorn I S，Engberts JB，Hoekstra D．Gene delivery by cationic lipid vectors：overcoming cellular barriers［J］．Eur Biophys J，2007，36（4－5）：349－62．

［13］Smith CC，Lynch AM，Gooderham N J．Evaluating the genetic toxicology of DNA-based products using existing genetic toxicology assays［J］．Mutagenesis，2003，18（3）：259－64．

［14］Valero A，Post JN，van Nieuwkasteele JW，et al．Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device［J］．Lab Chip，2008，8（1）：62－7．

［15］AkashiH，MiyagishiM，Taira K．RNAi expression vectors in plant cells［J］．Methods Mol Biol，2004，252：533－43．

［16］Sandri M，Bortoloso E，Nori A，et al．Electrotransfer in differentiated myotubes：a novel，efficient procedure for functional gene transfer［J］．Exp Cell Res，2003，286（1）：87－95．

中图分类号R 382．33

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1367－06

基金项目：国家自然科学基金（编号：81471983，81171606）；安徽省高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2014A106）

作者单位：1安徽医科大学病原生物学教研室，合肥230032；安徽医

作者简介：谢园园，女，硕士研究生；

Experim ental study of Toxoplasma ROP16 gene transfection to RAW 264.7

Xie Yuanyuan1，Xu Yuanhong2，Wen Huiqin2，3，et al
（1Dept of Pathogen Biology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Dept of Laboratory，3Dept of

Blood Transfusion，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveFivemost commonly usedmethodswere compared to transfer Toxoplasma gondii rhoptry 16 gene into RAW264．7 in order to select the appropriate technique for improving transfection efficiency．Methods The following fivemethods of LipofectamineⓇ3000 Transfection Reagent，Attractene Transfection Reagent，FugeneⓇHD Transfection Reagent，electroporation transfection and lentiviral vectors were used to construct the recombinant plasmids and lentiviral vectors，which carried genes of Toxoplasma ROP16 and pEGFP fusion protein．RAW264．7 cells were subjected to transfection with the constructs individually．Then the expressions of the target gene，cellularmorphology and transfection efficiency were observed with fluorescencemicroscopy and flow cytometry．Results The transfection efficiency of the recombinant plasmids in RAW264．7 goes as follows：electroporation＞FugeneⓇHD＞LipofectamineⓇ3000＞Attractene．However，the plasmids-transfected host cells became vulnerable to deaths via electroporation．Comparatively，the high efficacy of 61．2%was achieved with lentivirus infection（P＜0．05）．In addition，statistic analyses showed that lentivirus infection of the host cells had obvious advantages over the tested plasmid vectors（P＜0．05）．ConclusionToxoplasma gondii ROP16 has been successfully transferred to RAW264．7 macrophages by lentivirus infection，which resultes in higher efficiency of tranfection and expression of Toxoplasma gondii ROP16 gene in the cells than those by plasmids．

Key wordsROP16 gene；RAW264．7；lentivirus infection