m iR-210促进人牙周膜干细胞血管向分化作用的初步研究

古　月，王银龙

m iR-210促进人牙周膜干细胞血管向分化作用的初步研究

古月，王银龙

摘要目的构建miR-210的慢病毒载体（Lenti-miR-210-Luciferase），转染人牙周膜干细胞（hPDLSCs）后，检测成血管因子低氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）在hPDLSCs的表达。方法分离培养hPDLSCs，并根据人miR-210基因（NC＿000011．9）序列行引物设计及序列片段的PCR扩增，将目的基因PCR产物连接到载体pLVX-EGFP-3FLAG-EF1-Luc上。将目的基因PCR产物和目的载体用EcoRⅠ和XbaⅠ分别进行酶切，对质粒进行鉴定。采用LR重组系统构建慢病毒载体Lenti-miR-210-Luciferase（Lenti-LacZ-Luciferase为对照组）。转染hPDLSCs后，通过qPCR和免疫组化法检测HIF-1α及VEGF的表达。结果通过对构建质粒克隆进行测序及酶切，证实Lenti-miR-210-Luciferase构建成功。Lenti-miR-210-Luciferase转染hPDLSCs，0、1、4、7、14 d后行qPCR检测，结果表明第4天HIF-1α和VEGF明显过表达，且持续到第14天。免疫组化结果显示，miR-210转染hPDLSCs后，抗HIF-1α和抗VEGF染色呈阳性，对照组呈阴性。结论成功构建了慢病毒载体Lenti-miR-210-Luciferase，并且miR-210具有促进hPDLSCs血管向分化的作用。

关键词牙周膜干细胞；miR-210；低氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子；慢病毒载体

microRNAs（miRNAs）是一种内源性非编码的单链小分子RNA，长度为20～22个核苷酸，到目前为止，人类基因组中有超过1 400个miRNA序列（1 424 miRbase：17．0）［1］。参与血管生成的内皮miRNAs，也被称为angiomiRs［2］，其中miR-210在细胞低氧时高表达，在组织缺血时，miR-210对调控内皮细胞血管化具有决定性的作用［3］。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周组织中的成体干细胞，具有高度增殖、自我更新能力和多分化潜能［4－5］。临床上人牙周膜干细胞（human PDLSCs，hPDLSCs）易于获得，且不会引起额外的创伤。随着组织工程技术的发展，把hPDLSCs作为转基因靶细胞修复受损组织或器官具有重要的临床应用价值。该研究用慢病毒（Lenti-miR-210-Luciferase）转染hPDLSCs后，检测低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，旨在证明miR-210可以促进hPDLSCs血管向分化作用，为miR-210介导的hPDLSCs进行体内实验研究奠定基础。

1　材料与方法

1．1材料DMEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；10%胎牛血清（美国HyClone公司）；Realtime PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；一抗、二抗（英国Abcam公司）；NEAA、HEPES、pDONR221、高保真DNA聚合酶（platimumpfx DNA Polymerase）、pLenti6．3／V5-DEST、载体构建试剂盒（BLOCK-iTTM PolⅡmiRRNAi ExpressionVector Kitwith EmGFP）、表达载体pcDNATM6．2-GW／EmGFPmiR、病毒包装细胞系293T、Packaging Mix及限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ（英国Invitrogen公司）。

1．2实验方法

1．2．1hPDLSCs的分离和鉴定

选择11～18岁因正畸需要减数拔除前磨牙的患者，收集前获得患者及其监护人的知情同意。临床取材后，在超净工作台内，将牙齿牙冠向下用滴管吸取无血清DMEM培养液冲洗牙齿约30 s，以冲去牙齿上可能粘附的血液、异物或细菌等。然后将牙冠部分浸入75%酒精内消毒约2 min，再用无血清DMEM培养液冲洗牙齿约30 s。无菌条件下用锐利手术刀片刮取牙根中部1／3的牙周膜组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎块，以5 mm间隔均匀铺于6 cm培养皿底，加入1 ml含20%FBS、100 U／ml青霉素和100 U／ml链霉素的DMEM培养液，倒置于孵箱内，3 h后待组织块贴壁完全，翻转培养皿，加入3 m l上述DMEM培养液，继续培养，倒置相差显微镜下观察细胞的生长及排列情况。从第4天开始，每3～5 d换液1次，7～15 d左右当细胞从组织块周围游出并

2015－05－08接收

1．2．2hsa-miR-210过表达载体构建

载体pLVXEGFP-3FLAG-EF1-Luc GENEBANK中人miR-210基因（NC＿000011．9）位于11p15．5染色体上。根据人miR-210基因序列信息设计引物及序列片段的PCR扩增。引物信息如下：hsa-miR-210-EcoR I：FCTCAAGCTTCGAATTCGGCTCGGACGCCCAAGTT；hsa-miR-210-Xba I：RCGCAGATCCTTCTAGACAGCCTCAGCCCCACCAA。下划线处分别为EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点。

将目的基因PCR扩增产物和目的载体pLVXEGFP-3FLAG-EF1-Luc用EcoRⅠ和XbaⅠ分别进行酶切。电泳分离酶切片段，切胶回收目的片段。目的基因与载体片段同源重组后转化E．coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误的克隆进行质粒抽提。

1．2．3构建慢病毒载体

利用pLVX-EGFP-3FLAG-EF1-Luc作为载体，采用萤火虫的荧光素酶（Luciferase）作为报告基因，为本实验提供特异、稳定、高效的表达标记，使用Invitrogen公司的慢病毒系统（Lentivirus）包装，将慢病毒载体Lenti-miR-210-Luciferase和 Lenti-LacZ-Luciferase分别转染293T细胞，收集病毒液后进行浓缩。

1．2．4慢病毒液滴度测定

将收集到的慢病毒液冰水浴融化后，用含有polybrene 8μg／m l和2% FBS的细胞培养液进行10倍比滴度稀释后感染HEK293细胞，观察各稀释孔病毒感染情况并计数，根据可数的最小梯度稀释孔的荧光细胞数目计算慢病毒滴度。经检测本实验制备的病毒滴度为1× 108，完全满足本实验的需要。

1．2．5热成像检测实验

hPDLSCs培养至第3代，根据慢病毒的滴度（1×108），按照每孔2×105个细胞接种于6孔板中，待细胞生长至70%～80%融合时，加入相应体积的慢病毒转染hPDLSCs，目的基因转染hPDLSCs后，进行热成像检测试验。

1．2．6体外检测miR-210促进hPDLSCs成血管作用

1．2．6．1qPCR检测成血管因子HIF-1α及VEGF的表达

在培养皿中分别放入Lenti-miR-210-Luciferase／hPDLSCs、Lenti-LacZ-Luciferase／hPDLSCs及hPDLSCs培养，后两者为对照组。然后在转染后0、1、4、7、14 d提取总RNA行qPCR检测HIF-1α和 VEGF表达。

1．2．6．2细胞免疫组化及细胞核染色检测HIF-1α及VEGF蛋白的表达

将转染成功后的细胞接种于培养皿中，5 d后进行免疫组化染色，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗去固定液；乙醇溶液梯度水化；3%过氧化物消除内源性过氧化物酶；EDTA修复；在1%BSA封闭液中室温封闭30 min～1 h；加入即用型一抗（鼠抗人HIF-1α单抗，鼠抗人VEGF单抗），4℃冰箱过夜；PBS清洗，加入二抗，温育0．5 h，冲洗后DAB显色，苏木精对比染色，中性树脂封片，显微镜下观察结果。

1．3统计学处理

2　结果

2.1原代培养hPDLSCs的观察

原代培养hPDLSCs 5 d左右，组织块周围有细胞爬出。细胞大部分呈梭形，似成纤维样细胞（图1）。

2.2Lenti-m iR-210-Luciferase和Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体构建

利用pLVX-EGFP-3FLAG-EF1-Luc作为载体，目的基因同源重组入表达载体的阳性克隆鉴定（图2）。

2.3目的基因转染hPDLSCs后热成像检测

实验结果表明Lenti-miR-210-Luciferase转染hPDLSCs（图3A）后，热成像检测结果表明Luciferase高表达（图3B）。

2.4qPCR检测m iR-210促进hPDLSCs血管向分化作用

采用慢病毒载体，用miR-210转染hPDLSCs，在转染后0、1、4、7、14 d提取总RNA行qPCR检测关键成血管因子HIF-1α和VEGF表达。在转染后的第4天，HIF-1α和VEGF明显过表达，HIF-1α在第7天达峰值，第14天时仍维持在较高水平；VEGF直到第14天仍有上升趋势。hPDLSCs和Lenti-LacZ-Luciferase组也有HIF-1α和VEGF的表达，与Lenti-miR-210-Luciferase组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。见图4。

2．5免疫细胞化学染色

miR-210转染hPDLSCs后进行染色，结果显示，抗HIF-1α和抗VEGF染色呈阳性（细胞核有棕色反应），对照组呈阴性（细胞核为蓝色）。见图5。

3　讨论

节段性骨缺损（segmental bone defect，SBD）的修复是目前临床医学亟待解决的难题之一。随着材料学、分子生物学及基因治疗学的发展，运用基因增强的组织工程技术修复骨缺损成为当前的研究热点［6－8］。但在修复SBD时，组织工程骨的血管化问题是制约其最终治疗效果的关键因素。构建有效的血管化组织工程骨是当下必须要解决的一个课题，目前的研究重点主要集中在以下几个方面：①血管化支架材料的构建；②血管生长因子的应用；③血管细胞和干细胞的血管化；④显微外科技术修复血管［9］。在运用基因增强的组织工程技术修复骨缺损的研究中，基因调控种子细胞的成血管作用日益受到关注，并在一系列动物实验中得到满意的效果，如骨形成蛋白-2、核心结合因子1、碱性成纤维细胞生长因子、VEGF等［10－11］。

miR-210是一种由低氧诱导表达的miRNA，已证实miRNA-210在低氧导致的血管新生过程中表达量明显上升，因此被称为低氧特异性miRNA（hypoxamir），其表达比较稳定［12］。采用慢病毒载体可以使miR-210在体内稳定表达，而且在病毒载体上连接Luciferase可以体内示踪目的基因在体内表达。所以本实验构建了Lenti-miR-210-Luciferase的慢病毒载体，qPCR结果显示转染目的基因的hPDLSCs过表达HIF-1α和VEGF，Lenti-miR-210-Luciferase组的表达明显高于hPDLSCs和Lenti-LacZLuciferase组，hPDLSCs和 Lenti-LacZ-Luciferase组也有少量表达，这可能是由于hPDLSCs本身具有内源性的HIF-1α和VEGF基因。hPDLSCs转染miR-210基因后，HIF-1α和VEGF的mRNA表达明显增加。与Lenti-miR-210-Luciferase组比较，hPDLSCs和Lenti-LacZ-Luciferase组HIF-1α和VEGF的表达都维持在较低的水平，说明使用慢病毒载体后并没有影响HIF-1α和VEGF基因mRNA的合成。miR-210转染hPDLSCs后进行免疫组化染色，结果显示，抗HIF-1α和抗VEGF染色呈阳性，对照组染色呈阴性。与对照组比较，转染miR-210的hPDLSCs表达HIF-1α和VEGF。虽然qPCR结果显示Lenti-LacZ-Luciferase组可少量表达HIF-1α和VEGF，但免疫组化染色未能检测出这两种因子，可能是因为Lenti-LacZ-Luciferase组表达的量过少以致染色无法显示。本实验结果揭示了miR-210具有促进hPDLSCs血管向分化的作用。然而，由于本实验只是miR-210具有促进hPDLSCs血管向分化作用的体外实验部分，在未来的研究中可以构建动物模型研究miR-210介导的血管化组织工程骨在修复骨缺损中的作用，以期为临床上有效解决SBD的生物功能重建提供可靠的实验依据。

血运重建被认为是骨组织工程继种子细胞、支架材料、细胞因子三大要素之后的第四大要素，如何解决组织工程骨的血管化问题是目前需要解决的一个关键问题。miR-210是血管形成的调控因子，能否采用组织工程技术，以hPDLSCs为靶细胞，利用miR-210构建血管化组织工程骨有待进一步研究。本实验旨在为将来应用miR-210介导的hPDLSCs重建血管和修复骨缺损的体内外研究奠定基础。

参考文献

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中图分类号Q 782；Q 342

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1381－05

基金项目：安徽省科技厅重点课题（编号：10021303003）

作者单位：安徽医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，合肥230032

作者简介：古月，女，硕士研究生；王银龙，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangylah＠sina．com达70%～80%融合时，0．25%胰酶消化传代，首次传代比例为1∶1。所用的细胞需要经过2代扩增。第3代细胞接种24 h后进行基因转染。

The prelim inary research ofm iR-210 promoting human periodontal ligament stem cells the differentiation of angiogenesis

Gu Yue，Wang Yinlong
（Dept of Oral and Maxillofacial Surger，The Affiliated Stomatology Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo construct the lentiviralvector Lenti-miR-210-Luciferase，and to detectangiogenic factorsHIF-1αand VEGF expression in hPDLSCs transduced by Lenti-miR-210-Luciferase．MethodshPDLSCswere isolated and cultured，and according to humanmiR-210 gene sequence（NC＿000011．9），its primerwas designed and amplified through PCR．The PCR products of the target gene were connected to the vector pLVX-EGFP-3FLAGEF1-Luc．To identify the plasmid，target gene PCR product and the purpose vectorwere digested by EcoRⅠand XbaⅠ．Lenti-miR-210-Luciferase（the control group was Lenti-LacZ-Luciferase）was constructed using the LR recombination system．After hPDLSCs was transduced by Lenti-miR-210-Luciferase，the analysis of HIF-1αand VEGF expression was done with qPCR and the immunohistochemistry examination．ResultsThe results of plasmid sequencing and digestion confirmed that the vector Lenti-miR-210-Luciferase was successfully constructed．After Lenti-miR-210-Luciferasewas transduced to hPDLSCs on 0，1，4，7 and 14 d，the results of qPCR showed that the over-expression of HIF-1αand VEGFwas detected on 4 d，and continued until21 d．Immunohistochemical results showed that after hPDLSCswere transduced by Lenti-miR-210-Luciferase，hPDLSCswere positive for HIF-1αand VEGF antibody，and the control group was negative．ConclusionThe Lenti-miR-210-Luciferase is successfully constructed，and miR-210 can promote hPDLSCs the differentiation of angiogenesis．

Key wordsperiodontal ligament stem cells；miR-210；hypoxia inducible factor-1α；vascular endothelial growth factor；lentiviral vector