生物合成对羟基苯甲酸的研究进展

朱莉，许超艳，李晶晶，田俊，冯昭中，彭学



生物合成对羟基苯甲酸的研究进展

朱莉，许超艳，李晶晶，田俊，冯昭中，彭学

江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州 221116

朱莉, 许超艳, 李晶晶, 等. 生物合成对羟基苯甲酸的研究进展. 生物工程学报, 2015, 31(3): 328–337.Zhu L, Xu CY, Li JJ, et al. Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 328–337.

对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate，4HBA) 是用途广泛的有机原料，现行的生产工艺是以石油成分合成而得，在环境污染不断恶化、人类生存已经面临威胁之际，开发利用可再生资源的生产工艺已成为全球当务之急。本综述在简要介绍从石油成分合成4HBA之后，主要阐述利用植物和微生物从可再生资源合成4HBA的研究进展。莽草酸途径是生物合成芳香族化合物的重要途径，从该途径的最终产物分支酸到4HBA有两条途径。一条是分支酸裂解酶直接催化分支酸生成4HBA (莽草酸-分支酸路线)。另外一条途径是在植物细胞内引入荧光假单胞菌的对羟基肉桂酸-CoA裂解酶打通从苯丙素合成4HBA的通路 (植物苯丙素路线)。最后介绍了一个天然合成积累4HBA的微泡菌，并对其深入研究进行了展望。

对羟基苯甲酸，合成生物学，莽草酸途径

对羟基苯甲酸 (4-Hydroxybenzoate，4HBA) 是用途广泛的有机合成原料，主要应用于食品、化妆品、医药的防腐和防霉剂、杀菌剂的合成方面。2002年，我国4HBA的生产量为6 000 t，并以每年11.4%的速度递增，预计2014年的生产量可达20 000 t以上[1]。4HBA的用途之一是4HBA酯类的合成，该酯类化合物的英文名为Paraben，其中甲酯又名为尼泊金甲，乙酯又名为尼泊金乙，是目前使用最多的防腐剂[2]。4HBA的另外一个重要用途是合成液晶高分子[3]。液晶是在1959年利用4HBA的乙酸酯经熔融和固相聚缩合后首次获得，后来经过改良成具有实用价值的材料。现在市场上的液晶商品“Xydar”是4HBA、对苯二酚和酞酸的聚合物；“X-7G”是4HBA和聚对苯二甲酸乙二酯在熔融状态下的聚合物；“Vectra”是4HBA和2-羟基-6-萘甲酸熔融聚合物；“Tian”是4HBA和2-羟基-6-萘甲酸及对苯二酚的聚合物。

随着电子信息化社会的不断发展，4HBA的市场需求量日益增加，现行的4HBA生产工艺是从石油成分合成而得，在环境污染的不断恶化、人类的生存已经面临威胁之际，利用可再生资源代替以石油为原料的生产工艺已成为全球当务之急。4HBA的化学结构类似于芳香族氨基酸，在理论上利用生物的芳香族氨基酸合成途径，即莽草酸途径(Shikimate pathway) 可以合成4HBA。这篇综述首先介绍现行的4HBA化学合成工艺，然后着重阐述利用植物和微生物从可再生资源合成4HBA的实例，为生物合成4HBA提供理论依据。

1 从石油成分合成4HBA

1.1 化学合成

现行的4HBA生产工艺是以石油产物的苯(Benzene) 和丙烯(Propylene) 出发，在催化剂氯化铝的存在下高温高压合成异丙苯(Cumene)，然后将异丙苯在80−130 ℃左右用氧气氧化成过氧化氢异丙苯(Cumenehydroperoxide) (图1A)。过氧化氢异丙苯在酸性和60−100 ℃条件下生成苯酚(Phenol)[4]。从苯酚到4HBA的制备有多种方法。常规工艺是利用Kolbe-Schmitt反应，即将苯酚加入KOH制备成酚钾盐，然后与二氧化碳在高温高压下进行气固相羧基化反应生成4HBA。整个合成工艺必须在高温高压下进行，需要消耗大量能源导致生产效率低成本高。特别是合成途径中有环境污染物质苯酚的生成，给工业排水的处理带来很大困难[5]。

1.2 生物转化

白色生物技术(White biotechnology) 是近年来提出的新概念，即利用已知的代谢调节机理对各种微生物进行改造，构建成一个“细胞工厂”，使其更好地服务于人类。甲苯(Toluene) 是石油中的一种没有得到有效利用的芳香族成分，一些研究人员利用白色生物技术将恶臭假单胞菌DOT-T1E改造成一个从甲苯合成4HBA的细胞工厂[6-9](图1B)。DOT-T1E菌株本来是甲苯降解菌株，且耐有机溶剂。DOT-T1E菌株降解甲苯的第一步骤是由甲苯双加氧酶催化将甲苯氧化为-甲苯2,3-二氢二醇(-Toluene 2,3-dihydrodiol)，该酶由基因编码。基因编码的脱氢酶将-甲苯2,3-二氢二醇氧化成3-甲基苯二酚(3-Methylcatechol)，然后开环后进入三羧酸循环。

Ramos-González等[6]将编码甲苯双加氧酶基因中的基因敲除，同时将该菌株的基因也敲除掉构建成一个甲苯营养缺陷型(DOT-∆∆)，编码的是4HBA-4-羟化酶，催化氧化4HBA成原儿茶酸(Protocatechuate) 的反应。DOT-∆C∆成为不能降解甲苯和4HBA的菌株。在此遗传背景下，负责转化甲苯至4HBA的一系列基因从门多萨假单胞菌KR1菌株引入到该菌株的染色体中，构建成DOT-T1E-24菌株。这一系列基因包括：，编码甲苯单加氧酶，催化的反应是在甲苯的4位引入一个羟基生成甲酚(-Cresol)；编码甲酚单加氧酶，催化将甲酚氧化为4-羟基苯醇(4-Hydroxybenzyl alcohol) 和进一步氧化为 4-羟基苯醛(4-Hydroxybenzyl aldehyde) 的两步反应；编码4-羟基苯醛脱氢酶，催化生成4HBA的反应。在摇瓶分批培养条件下DOT-T1E-24菌株成功将甲苯转化成4HBA，并得到12 mmol/L的积累记录。从石油成分甲苯出发，理论上一个甲苯可以合成一个4HBA。

图1 利用石油成分和可再生资源的4条4HBA合成途径

2 利用植物的生物合成

2.1 利用莽草酸途径的4HBA合成

莽草酸途径由7步反应合成分支酸(Chorismate)，是普遍存在于植物、真菌和细菌中的一条重要芳香族氨基酸合成代谢途径。第一步是赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸缩合成一个七碳酮糖开环磷酸化合物，3-脱氧-β-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)[10]。磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖4-磷酸分别是糖酵解途径和磷酸戊糖途径上的重要中间代谢产物。分支酸是合成酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的分支点，从分支酸到4HBA的合成途径有3条。

第一条是分支酸裂解酶(Chorismate lyase，UbiC) 直接催化分支酸生成4HBA (分支酸裂解酶途径)[11-12](图1C)。第二条是利用合成苯丙素(Phenylpropanoids) 的途径(苯丙素途径) (图1D)。苯丙氨酸解氨酶催化脱掉芳香族氨基酸上的氨基生成相应的苯丙素，然后和CoA链接成对羟基肉桂酸-CoA (4-Hydroxycinnamoyl-CoA)。对羟基肉桂酸-CoA裂解酶(4-Hydroxycinnamoyl-CoA lyase，HCHL)，催化对羟基肉桂酸-CoA的侧链生成对羟基苯甲醛 (4-Hydroxybenzaldehyde)，然后该产物被氧化成4HBA[13]。基因在植物中不存在，从外源引入后能打通从苯丙素合成4HBA的通路。第三条在胡萝卜中被发现，属于对羟基肉桂酸-CoA非依赖途 径[14-16]。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的催化下生成肉桂酸(Cinnamate)，肉桂酸羟化酶在4位引入一个羟基，生成对羟基肉桂酸，再通过非氧化途径(Non-β-oxidative route) 合成4HBA。植物细胞是从CO2合成的，无论哪条途径，其理论得率是4HBA/7CO2。

2.2 重组植物

利用重组烟草作为4HBA的生产宿主有两个报道。一是Mayer等[17]在烟草的细胞质内表达荧光假单胞菌AN103的基因，使酪氨酸能够生成4HBA。获得的4HBA产量为烟草总量的2.9%，但是得到的4HBA都是葡糖基化产物，而且重组烟草的生长受到影响。二是杜邦公司的Viitanen等[18]和Sommer等[19-20]把大肠杆菌的基因转化到烟草的叶绿体染色体上，并在其上游插入在叶绿体中特异转录的启动子。基因在烟草的叶绿体内表达成功，并合成了4HBA，产量为烟草总量的13%，但得到的4HBA也都是葡糖基化产物。

另外利用植物作为4HBA生产宿主的还有Rahman等[21]把基因重组到甜菜染色体中合成了葡糖基化和酯化4HBA，产量为甜菜总重的14%。Mitra等[22]把荧光假单胞菌AN103的基因重组到曼陀罗甜菜染色体中合成了葡糖基化和酯化4HBA，产量为曼陀罗甜菜总重的0.5%。McQualter等[23]向甘蔗内分别导入了基因和基因，比较了4HBA的产量，发现基因重组株的产量高于基因重组株。从基因重组株的叶子里得到葡糖基化和酯化4HBA，产量为叶子总重的7.3%。利用0.1 mol/L的NaCl水解葡糖基化和酯化4HBA可以获得4HBA。

利用光合作用的植物合成4HBA的最大优点是直接利用二氧化碳，省去了繁琐的木质纤维素的糖化过程。但是植物细胞中含有葡糖基转移酶，将4HBA葡糖基化或酯化，给下游提纯工程带来困难。另外利用胡萝卜、甜菜和甘蔗等食物资源生产工业原料会造成粮食价格的上涨，给社会带来不安定因素。

3 利用微生物的生物合成

3.1 大肠杆菌Escherichia coli

利用微生物生产4HBA的研究和植物相比比较少。美国密歇根州立大学的Frost教授课题组[24]对大肠杆菌进行了一系列的重组转化，构建了一株重组菌从葡萄糖生物合成了4HBA。在大肠杆菌中生物合成的4HBA没有被糖基化或酯化。该课题组利用的菌株是D2704 []，合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的3个基因(、和) 均被敲除。因此培养D2704时必须在培养基中加入3种芳香族氨基酸。在D2704的染色体上引入了3个外源基因：一个是经过诱变的DAHP合成酶基因aroF，其酶活性不受中间代谢产物的反馈抑制；二是分支酸裂解酶基因，负责将分支酸转化成4HBA；三是转酮醇酶基因，用来大量提供莽草酸途径的中间体赤藓糖4-磷酸。最后向该重组菌中转化了一个在启动子下高效表达一系列莽草酸途径基因的质粒，包括3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因、莽草酸激酶基因、分支酸合成酶基因和3-脱氢奎尼酸基因。最终构建的菌株名为JB161 [pJB2.274]。在实验室规模上生产了12.0 g/L 4HBA (98.4 mmol/L)，对葡萄糖的收率为13%。另外Barker等[24]还调查了4HBA对大肠杆菌的毒性。实验证明10 g/L的4HBA会抑制大肠杆菌的生长繁殖，同时抑制了莽草酸的中间体3-脱氢莽草酸的产量。以上实验说明利用重组大肠杆菌生产的4HBA虽然没有被糖基化或酯化，但是4HBA对大肠杆菌表现出了毒性，提高产量比较困难。另外培养基中需要添加芳香族氨基酸，使培养基的制备复杂化而且生产成本提高。

3.2 恶臭假单胞菌Pseudomonas putida

恶臭假单胞菌S12是一个耐有机溶剂菌株，Verhoef等[25-26]将其4HBA羟化酶(4HBA hydroxylase) 基因敲除后，转化了一个载有苯丙氨酸解氨酶 (Phenyalanine ammonia lyase，Pal) 基因的质粒，构建成S12palB1菌株，该菌株失去了降解4HBA的能力。S12palB1菌株能将酪氨酸通过苯丙氨酸解氨酶转化为对羟基肉桂酸，然后利用对羟基肉桂酸降解途径合成4HBA。以葡萄糖为初始基质在摇瓶中培养S12palB1菌株得到11% 4HBA/葡萄糖(Cmol%)。为了提高莽草酸途径的前体赤藓糖-4-磷酸的供应，Meijnen等[27]将大肠杆菌的木糖降解基因引入到S12palB1菌株的染色体上构建成S12xylB7菌株，使该菌株获得了利用木糖的功能。基因分别编码木糖异构酶和木酮糖激酶，催化木糖转化为木酮糖-5-磷酸的反应，构建了从木糖到赤藓糖-4-磷酸的途径。在同时提供甘油和木糖的培养基中，合成出来的4HBA对基质的收率为16.3% (Cmol%)。4HBA是从葡萄糖合成而得，如果葡萄糖的6个碳在发酵过程中没有生成CO2释放出去，全部用于4HBA的合成，那么碳的理论收率 (Cmol%) 应该为100%，而质量的理论收率() 为65.6%[28]。从这个数字来看，开发改造的潜力非常大。

3.3 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae

Krömer等[29]将酿酒酵母的编码分支酸变位酶(Chorismate mutase) 基因敲除掉构建成菌株，因此该菌株是酪氨酸和苯丙氨酸的营养缺陷型。然后把载有大肠杆菌基因的质粒转化进菌株中构建成pCV3-UBIC菌株。该菌株从83.3 mmol/L葡萄糖合成了650 μmol/L的4HBA，相当于0.6% 4HBA/葡萄糖。产量不是很理想，这是由于大肠杆菌的基因的密码子偏好性和酿酒酵母的差异很大，基因没有得到有效表达。迄今为止没有发现酿酒酵母的基因，今后只能通过人工改良大肠杆菌的基因来提高4HBA的产量。另外酿酒酵母也不存在对羟基肉桂酸降解途径，从酪氨酸合成4HBA的难度很大。利用酿酒酵母作为4HBA合成宿主的最大优点是糖利用效率高，而且高浓度的糖不抑制菌株的生长繁殖。

4 微泡菌Microbulbifer的次级代谢产物

4.1 微泡菌Microbulbifer

微泡菌又称溶藻细菌，属于变形菌纲，广泛分布于海洋环境中，它生产的生理活性物质以及海藻成分降解酶等越来越受到人们的重视[30-32]。2006年，本课题组首次发现从海洋环境中分离出的微泡菌菌株有合成4HBA和4HBA酯类的功能，在我们的调查范围内A4B-17菌株所合成的量最 多[33]。后来Quévrain等[34]在2009年也报道了他们分离的微泡菌菌株也合成了4HBA。合成积累4HBA和酯类是微泡菌的一个特征。4HBA是芳香族高分子木质素的降解产物，在土壤环境中很多微生物拥有降解4HBA基因，4HBA不会在体内外积累[35-37]。微泡菌是在海洋环境中生存的微生物，表现出和土壤环境不同的面目，不但不降解而且还合成积累4HBA。

4.2 微泡菌sp. A4B-17菌株

微泡菌sp. A4B-17菌株在含有葡萄糖的培养基中培养时有合成积累4HBA和其酯化物的功能，当细胞进入稳定期后在培养基里积累了10 mg/L的4HBA和各种酯化物，总量约30 mg/L。虽然4HBA的量不是很高，但是野生菌株合成积累4HBA的能力是首次发现。如果适当发挥其天然潜力，对A4B-17菌株的4HBA合成基因进行改造，有希望合成更多的4HBA，以满足工业生产的需求。

4HBA和相应醇类酯化后的产物叫4HBA酯类 (Parabens)。1920年，人工合成并发现4HBA酯类有抑菌作用后，由于4HBA酯类具有价格便宜、无色、无毒、较为广泛的抑菌谱且抑菌作用不受pH影响等特点，现在作为防腐剂广泛应用于食品和化妆品的保存方面[38-40]。以前认为4HBA酯类是人工化合物，我们的发现阐明微泡菌早已经把它们当作抑菌剂，遏制周围微生物的生长繁殖扩大自己的生存空间。通过A4B-17菌株的次级代谢产物的研究也会使我们了解海洋环境中微生物与微生物之间的拮抗作用。研究还发现，A4B-17菌株的次级代谢产物中含有4HBA丁酯、4HBA壬酯和4HBA庚酯，而且是按照梯度“4HBA丁酯>4HBA壬酯>4HBA庚酯”合成出来的。而这个梯度具有生理意义，是有效抑制微生物生长的合理梯度。是什么调控机制使A4B-17菌株按照这个梯度合成4HBA酯类，这个梯度是否受到环境因素的影响？这些问题将在今后的研究中阐明。

本课题组完成了A4B-17菌株的基因组测序和注释工作。A4B-17菌株不含有质粒，只有一个染色体，全长为5 040 512 bp，共预测出4 766个基因。A4B-17菌株有3条葡萄糖降解途径 (糖酵解途径、磷酸戊糖途径和Entner-Doudoroff (ED) 途径)。而且还预测出一些酶催化连接这3条途径的反应，因此从葡萄糖至烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸的途径非常通畅。

5 展望

利用植物合成4HBA的缺点是4HBA在植物中是以葡糖基化或酯化产物的形式存在，给下游提纯工程带来困难，特别是苯丙素(Phenylpropanoids) 合成途径中的一些步骤尚不明了。利用细菌作为合成4HBA的细胞工厂有以下优点：1) 细菌的生长繁殖速度快，代谢周期短；2) 4HBA的合成可以部分利用细菌的芳香族氨基酸的合成途径；3) 4HBA对细菌的毒性较小，可以高浓度积累生产；4) 没有对环境和人类有害的中间产物生成；5) 在中国，苯、甲苯和葡萄糖的价格分别为每吨6 200、9 800和2 900元，而4HBA的价格为25 000元/t[41]。虽然从苯和甲苯出发理论上可以获得100%的4HBA收率，而葡萄糖转化为4HBA的理论收率也为65.6% (/)，葡萄糖的价格相对较低，经过计算理论上可以获得4 421元/t的4HBA。无论从环境角度还是经济角度利用微生物从可再生资源的葡萄糖合成4HBA，理论上要优于其他方法。

目前虽然利用重组微生物合成4HBA有一定的研究进展，但是这些微生物都是本身不合成积累4HBA的菌株，通过复杂的改造代谢途径和反馈调控机制会给4HBA的高效生产带来局限性。本课题组拟采取以下策略研究开发A4B-17菌株。1) 合成基因研究。通过基因敲除、表达谱分析等手段验证4HBA合成途径中的关键基因功能，如葡萄糖转运和磷酸化基因、赤藓糖-4-磷酸的合成基因、DAHP合成酶基因和分支酸裂解酶基因。2) 阐明关键部位的调控机制。4HBA和酯类都属于次级代谢产物，它们的合成必将受到各种因素的影响。我们假设3种因素 (内在因素、物化因素和抑制对象) 对代谢途径上的3个作用位点(PEP位点、4-磷酸赤藓糖位点、分支酸位点) 有一定影响。PEP位点包括PEP激酶和DAHP合成酶；4-磷酸赤藓糖位点包括转酮酶和DAHP合成酶；分支酸位点包括分支酸裂解酶、邻氨基苯甲酸合成酶 (Anthranilate synthase) 和分支酸变位酶。本课题组将利用天然合成积累4HBA的A4B-17菌株作为宿主，在深入研究代谢途径和调控机制的基础上开发合成4HBA的工业微生物。

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(本文责编 郝丽芳)

Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote

Li Zhu, Chaoyan Xu, Jingjing Li, Jun Tian, Zhaozhong Feng, and Xue Peng

,,221116,,

4-Hydroxybenzoate (4HBA) is an important chemical compound used for synthesis of liquid crystal. Production of 4HBA from renewable resources is an effective mean to solve problems such as environmental pollution and petroleum shortage. This review briefly introduces the chemical synthesis of 4HBA from oil compounds, and mainly describes the progress in 4HBA biosynthesis from renewable resources by plants and microorganisms. In most intriguing aspect of plant-based synthesis of 4HBA is the appeal of directly synthesizing a chemical from CO2. However, the glucosylation system in plant cells converting 4HBA to glucose conjugates, causing the post treatment a problem. The recombinant microorganisms produce pure 4HBA, but less efficient. A new strain ofhas ability to naturally accumulate 4HBA from glucose. Elucidation of the metabolic pathways and regulation systems would improve 4HBA synthesis efficiency.

4−hydroxybenzoate, synthetic biology, shikimate pathway

May 28, 2014; Accepted:October 15, 2014

Xue Peng. Tel/Fax: +86-516-83500033; E-mail: pengxue@jsnu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31240088), Science and Technology Project of Xuzhou (No. XM12B105), Jiangsu Science and Technology Agency Project (No. BK20141148).

国家自然科学基金 (No. 31240088)，徐州市科技项目(No. XM12B105)，江苏科技厅项目 (No. BK20141148) 资助。

2014-12-03

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140300.html