不明原因复发性自然流产患者FOXP3基因蛋白表达与启动子甲基化水平之间关系的研究

侯文汇 李银广 李珠玉 李婕 方利元 李小青 游泽山

基础研究论著

不明原因复发性自然流产患者FOXP3基因蛋白表达与启动子甲基化水平之间关系的研究

侯文汇 李银广 李珠玉 李婕 方利元 李小青 游泽山

目的探讨不明原因复发性自然流产(URSA)患者蜕膜组织中叉头样转录因子P3(FOXP3)基因的蛋白表达水平及其与启动子甲基化水平的关系。方法利用蛋白印迹法检测20例URSA患者(URSA组)和20名正常妊娠主动要求人工流产术的健康妇女(正常对照组)蜕膜组织中FOXP3蛋白表达情况，利用结合重亚硫酸盐的测序法(BSP)检测2组FOXP3基因启动子甲基化情况，并分析两者的相关性。结果URSA组蜕膜组织中FOXP3表达水平明显低于正常对照组(P<0.01)。BSP显示URSA组FOXP3基因启动子甲基化水平明显高于正常对照组(P<0.01)。FOXP3蛋白表达水平与FOXP3基因启动子甲基化水平呈负相关(r=-0.917，P<0.01)。结论FOXP3基因启动子甲基化水平升高后，FOXP3基因蛋白表达水平下调，引起免疫耐受异常，可能导致RSA的发病。

不明原因复发性自然流产；叉头样转录因子P3；基因启动子；甲基化

复发性自然流产(RSA)是指连续2次或2次以上(与同一性伴侣)的自然流产，其病因较复杂，除胚胎或流产夫妇的染色体异常、解剖异常、内分泌异常、感染等传统经典的四大原因外，约有40%～50%的患者原因不明，称原因不明RSA(URSA)。国内外研究表明，RSA与母胎免疫耐受的异常有关[1]。调节性T细胞(Treg)在母胎免疫耐受形成中起关键性作用，且Treg的形成和功能发挥又需要叉头样转录因子P3 (FOXP3)基因的稳定持续和高水平表达[2-3]。有报道，URSA患者外周血和蜕膜组织中Treg细胞数量明显减少且其功能受损，尤以蜕膜组织中明显[4-5]。另有学者报道，URSA患者存在FOXP3基因的低表达[5]。然而笔者尚未见有文献深入研究FOXP3基因低表达的内在机制。本研究试图从FOXP3基因表观遗传学方面探讨其表达下调的机制，进而为RSA的防治开辟新思路。

材料和方法

一、标本

1.URSA组

2012年至2014年在中山大学附属第一医院黄埔院区行清宫术的RSA患者，年龄25～41岁，中位年龄32岁。按以下标准纳入：流产次数≥2次，流产均发生在孕12周以前，胚胎绒毛染色体核型正常，绒毛全基因组高通量测序无微缺失或微重复。排除常见的夫妇双方染色体异常、女方生殖道畸形、基础性激素及黄体功能异常、男方精液检查异常。本研究选择符合标准的20例患者作为实验组。

2.正常妊娠主动要求人工流产患者(正常对照组)

同期在中山大学附属第一医院黄埔院区正常妊娠主动要求人工流产术的健康妇女，年龄25～41岁，中位年龄31岁，孕8～12周。按以下标准纳入：至少有1次成功妊娠史，无自然流产或死胎史，此次B超显示正常，绒毛染色体核型正常，绒毛全基因组高通量测序提示无微缺失或微重复。本研究选择符合标准的20例患者作为对照组。

3.标本采集

于清宫术中取出2组患者的胎盘蜕膜组织，洗净，迅速放入液氮中冻存，并转入-80℃冰箱保存。本研究经中山大学伦理委员会批准，每位参与者均被详细告知研究内容并签署知情同意书。

二、主要试剂

包括基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)、DNA亚硫氢酸盐处理纯化试剂盒(Qiagen，德国)、DNA凝胶回收试剂盒(Qbiosource，美国)、Amp(Amresco，美国)、DH5a感受态细胞(广誉生物，中国)、蛋白提取液(碧云天生物，中国)、十二羟硫酸钠(SDS，广州威佳)、甲醇 (广州化学试剂厂)、吐温-20(Sigma，美国)、脱脂奶粉(伊利)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio Rad，美国)、兔抗人FOXP3多抗(CST 美国)、辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗(博士德，中国)、ECL显色试剂盒(凯基生物)，重蒸水由Millpore纯水机制备，蛋白胨、酵母提取物均为英国Oxiod公司产品，2倍Fast Pfu酶预制混合物、T载体、T4 DNA 连接酶均为中国近岸生物科技有限公司产品，乙醇、氯化钠等均为国产分析纯试剂。

三、方法

1.蜕膜FOXP3蛋白表达水平的检测

使用蛋白免疫法检测。常规蛋白提取法提取蜕膜组织总蛋白，各组样品分别取总蛋白50 μg，5%的Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白质，并将其转移至PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭，加入稀释度为1∶1 000的一抗磷酸盐缓冲液(PBS)常温孵育2 h，以管家基因GAPDH(1∶1 500)为内对照。洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释度为1∶2 500)，常温孵育1 h，洗膜5次后，用ECL发光液1 ml显影，X光法曝光，成像系统进行光密度扫描，对结果进行统计学处理。

2.组织DNA的提取

按照基因组DNA提取试剂盒说明书所列的步骤在无菌条件下提取蜕膜组织DNA。

3.FOXP3基因启动子甲基化的检测

采用结合重亚硫酸盐的测序法(BSP)，对所提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理，步骤参照DNA亚硫氢酸盐处理纯化试剂盒说明书：将20 μl DNA样品与150 μl的转化试剂混合均匀，将混匀的转化体系在PCR仪中98℃ 10 min，64℃放置5 h。将反应液与600 μl结合缓冲液混合，加到离心柱中，10 000×g离心30 s，弃滤液。加洗涤缓冲液200 μl，10 000×g离心30 s，弃滤液。65℃预热洗脱缓冲液，将离心柱放入新的离心管中，加入30 μl洗脱缓冲液，10 000×g离心1 min，收集洗脱产物即为纯化的甲基化处理的DNA样品。用修饰后的DNA为模板进行PCR(上游引物5’-TATAATTAAGAAAAGGAGAAATATAGAGAG-3’；下游引物5’-TAAAACCCACATCTAATAAAAAAAA-3’)。总反应体系统50 μl：2倍Fast Pfu酶预制混合物25 μl，DNA模板5 μl，上、下游引物各2.5 μl，重蒸水15 μl。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s、62℃退火15 s、72℃延伸 30 s，共40个循环，最后72℃延伸5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切下目的条带。将凝胶回收的PCR产物连接入T载体，转化DH5a感受态细胞，涂布APM抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取阳性克隆10个，送往上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。研究表明，FOXP3基因在启动子区(-250 ～ +1 bp)，存在8个高度保守的CpG二核苷酸甲基化位点，经亚硫酸氢盐修饰后未甲基化的胞嘧啶(C)均被转换为胸腺嘧啶(T)，而被甲基化的C未被转化。比较2组蜕膜组织的FOXP3基因CpG位点甲基化水平。

四、统计学处理

结 果

一、URSA组与正常对照组蜕膜组织的FOXP3蛋白水平比较

URSA组蜕膜组织的FOXP3蛋白表达水平低于正常对照组(0.525±0.135vs. 0.817±0.191，t= 4.782、P<0.01)，见图1。

图1 URSA组与正常对照组蜕膜组织的FOXP3蛋白表达水平比较

二、URSA组与正常对照组蜕膜组织的FOXP3基因甲基化水平比较

URSA组FOXP3基因甲基化位点甲基化水平明显高于对照组(0.859±0.059vs. 0.712±0.099，t= 5.673、P< 0.01)，见图2。

图2 URSA组与正常对照组蜕膜组织的FOXP3基因启动子甲基化水平比较

三、FOXP3蛋白表达与基因甲基化的关系

FOXP3蛋白表达水平与基因甲基化水平呈负相关(r=-0.917，P<0.001)。

讨 论

研究表明，正常妊娠是一种成功的半同种异体移植现象，其关键在于母胎免疫耐受的形成使孕妇对胚胎半同种异体抗原不产生排斥反应。因此免疫耐受一旦被打破，就可能出现RSA等不良妊娠现象[6]。研究表明，RSA与免疫耐受有关[1]。Treg尤其是CD4+CD25+T细胞在母胎免疫耐受的形成过程中起关键性作用。最近，有学者提出用一种更合理、更符合自然流产发病原因复杂和多变性的模式，阐释免疫耐受异常导致RSA的发病机制，即免疫调节相关Th1/Th2/Th17/Treg细胞模式：自然流产患者外周血及蜕膜组织中在免疫耐受的诱导和维持中发挥关键性作用的Treg细胞明显低于正常妊娠者，而分泌多种促炎因子的Th1及Th17细胞明显升高，这打破了正常妊娠的免疫耐受模式而导致自然流产的发病[7-11]。

FOXP3属于人类转录调节因子之一，特异性的表达于CD4+CD25+T细胞。FOXP3基因的稳定持续和高水平表达是Treg的形成和功能发挥的关键[2-3]。梅珊珊等[12]研究发现，URSA患者外周血和蜕膜组织中Treg 细胞FOXP3表达比例低于正常早期妊娠妇女，且蜕膜局部FOXP3的变化较外周血更为灵敏。杨卉等[13]分别用免疫组织化学染色法、半定量和实时定量PCR法和蛋白免疫印迹法检测，发现URSA患者蜕膜组织中FOXP3表达明显低于正常早期妊娠妇女。本研究采用蛋白免疫印迹法分别检测URSA患者和正常早期妊娠妇女蜕膜组织的FOXP3表达，URSA组明显低于正常对照组，与前述报道基本一致。由此推测。FOXP3可能参与母胎界面妊娠免疫调节，其蜕膜组织中表达下降可能与RSA的发生有关。

然而FOXP3下调引起URSA具体的发生机制仍不明确。近年研究表明FOXP3长期和稳定的存在离不开以DNA 甲基化为代表的表观遗传学调控。已有研究证实，人类自然Treg中FOXP3的稳定表达需要以DNA甲基化为基础的表观遗传学修饰来控制。余鑫海等[14]研究发现，原发性干燥综合征患者Treg中FOXP3表达下调，其机制与FOXP3基因启动子区CpG岛甲基化有关。然而，目前国内外文献尚未见关于URSA患者甲基化水平的报道。本研究采用BSP法检测2组蜕膜组织FOXP3基因启动子区域甲基化水平，结果显示URSA组蜕膜FOXP3基因启动子区域甲基化水平明显高于正常对照组，且FOXP3蛋白表达水平与基因启动子区甲基化水平呈负相关，提示在RSA的发生、发展过程中，FOXP3基因启动子区域发生了甲基化，导致蛋白表达的减少或缺失，进而导致Treg细胞不能发挥免疫抑制作用，不利于正常母-胎免疫耐受的形成，从而导致RSA的发病。

综上所述，本研究初次从表观遗传学角度讨论URSA患者蜕膜组织FOXP3低表达可能由FOXP3基因启动子高水平的甲基化引起，使Treg免疫抑制功能受损，打破母胎免疫耐受，导致RSA的发病。

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AssociationbetweenFOXP3promotermethylationandtheexpressionofFOXP3proteininunexplainedrecurrentspontaneousabortion

HouWenhui，LiYinguang，LiZhuyu，LiJie，FangLiyuan，LiXiaoqing,YouZeshan.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

，YouZeshan,E-mail:youzeshan888@21cn.com

ObjectiveTo investigate the association between the level of FOXP3 promoter methylation and the expression level of FOXP3 protein in the decidua of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA).MethodsThe expression levels of FOXP3 protein in the decidua of 20 URSA patients and 20 healthy counterparts who underwent induced abortion were assessed by Western blot. Bisulfite-assisted genomic sequencing PCR (BSP) was utilized to detect the levels of FOXP3 promoter methylation. The correlation between two indexes was evaluated.ResultsThe expression level of FOXP3 in the decidua of the URSA group was significantly lower than that of the control group (P<0.01), whereas the level of FOXP3 promoter methylation in the URSA group was significantly higher compared with that in the control group(P<0.01). The expression level of FOXP3 protein was negatively correlated with the level of FOXP3 promoter methylation (r=-0.917,P<0.01).ConclusionAs the level of FOXP3 promoter methylation increases, the expression level of FOXP3 protein is down-regulated, which may cause abnormal immune tolerance and potentially lead to the incidence of RSA.

Unexplained recurrent spontaneous abortion; FOXP3; Promoter; Methylation

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.09.006

广东省自然科学基金(S2011010003522)

510080 广州，中山大学附属第一医院妇产科(侯文汇，李银广，李珠玉，李婕，李小青，游泽山)；510010 广州，广东省妇幼保健院(方利元)

，游泽山，E-mail: youzeshan888@21cn.com

2015-04-23) (本文编辑：林燕薇)