吡嘧司特对 OVA哮喘小鼠模型肺组织 IL-4m RNA、IL-5m RNA及IL-13m RNA表达的影响

毛 顺 （江苏省常熟市第五人民医院,江苏常熟215500）

·基础与转化医学·

吡嘧司特对 OVA哮喘小鼠模型肺组织 IL-4m RNA、IL-5m RNA及IL-13m RNA表达的影响

毛 顺 （江苏省常熟市第五人民医院,江苏常熟215500）

【摘 要】目的:了解口服吡嘧司特对IL-4mRNA、IL-5mRNA 及IL-13mRNA在小鼠哮喘模型肺组织的表达的影响,为临床治疗提供帮助和指导.方法:将40只SPF级的雄性BALB/C小鼠,采用随机分组方法分为对照组、哮喘组、开瑞坦组及吡嘧司特组,每组10只.哮喘组、开瑞坦组及吡嘧司特组使用卵清白蛋白（OVA,Grade V）致敏液建立哮喘模型,对照组以生理盐水代替OVA.同时给予开瑞坦组及吡嘧司特组模型小鼠连续四周分别喂养开瑞坦及吡嘧司特干预处理,并设立对照组,RT-PCR法检测四组小鼠肺组织IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA表达水平.结果:IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA在对照组小鼠肺组织呈低表达,在哮喘组中表达明显增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）.开瑞坦、吡嘧司特组小鼠IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA的表达抑制,且开瑞坦组与吡嘧斯特组在疗效上无明显差异（P＞0.05）.结论:吡嘧司特可能通过下调IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA的表达在哮喘治疗中发挥作用,在急性期治疗作用明显.

【关键词】吡嘧司特;开瑞坦;哮喘;炎性因子表达

0 引言

支气管哮喘（bronchial asthma,BA）是由多种细胞,包括炎症细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中心粒细胞等）、气道结构细胞（平滑肌细胞和上皮细胞）等和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病,是儿童常见的慢性呼吸道疾病之一,且发病率高［1-2］.据世界卫生组织的统计显示,全球每年约有1 500万人因哮喘丧失劳动能力,而我国哮喘患者的发病率、死亡率都呈逐年增高趋势［3］.哮喘病因情况复杂,在易感环境或因素下容易反复发作,是一种可控却难治的疾病［4］.因此,在对哮喘的相关研究中,发病机理、控制和预防是研究重点.2013-09/2014-10本研究通过观察吡嘧司特对哮喘小鼠肺组织IL-4、IL-5及IL-13mRNA表达的影响,探讨吡嘧司特能否抑制气道炎症介质的表达,从而有效控制哮喘发作.

1 材料和方法

1.1 材料 Balb/c小鼠,体质量20～25g,购自中国科学院伤害分院实验动物中心;402型超声雾化器（上海合力医疗器械厂）.卵清白蛋白（OVA,GradeⅡ～Ⅴ,生产批号:20130413）和氢氧化铝胶囊（500 g/瓶,生产批号:20130220）由美国Sigma公司提供;吡嘧司特（10 mg,生产批号:20130418）由南通飞马制药有限公司生产,开瑞坦（10 mg,生产批号: 20130405）由先灵葆雅公司生产.TRIzol由invitroge提供,RT-PCR试剂盒由Promega公司提供;PCR引物有上海生工公司提供.

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的建立与取材 4 0只Ba l b/c小鼠,鼠龄7周,体质量20～26 g,随机分为4组,哮喘组、吡嘧司特组、开瑞坦组、对照组,每组10只,饲养于20～25℃的恒温箱中.哮喘组、吡嘧司特组、开瑞坦组小鼠均在第1、8日腹腔注射0.5 m L OVA混悬液（含OVA 100μg）致敏,第15日起予OVA 10 g/L溶液超声雾化激发,30 min/d,连续7 d.对照组小鼠在第1、8日腹腔注射0.5mL生理盐水（NS）,第15日起予以雾化吸入NS 30 min/d,连续7 d.开瑞坦组小鼠在雾化吸入1 h后,予开瑞坦5 mg/kg口服,连续4周.吡嘧司特组雾化吸入1 h后,予吡嘧司特5 mg/kg口服,连续4周.哮喘组雾化吸入1 h后,予安慰剂5 mg/kg口服,连续4周.于首次激发4周后处死小鼠,迅速取下左肺组织冷冻后研磨,备用提取总蛋白及RT-PCR检测IL-4、IL-5、IL-13mRNA表达水平.切取右肺组织用0.9%氯化钠注射液洗净,10%甲醛固定后脱水,之后浸蜡包埋制作成蜡块,切片5μm行HE染色.

1.2.2 RT-PCR检测肺组织IL-4、IL-5、IL-13mRNA表达水平 肺组织冰冻后置于研钵中碾碎,采用TRIzol一步法提取总RNA［5］.以所得到的组织总RNA为模板,使用Promega公司的试剂盒进行逆转录反应,得到相应的cDNA.RT-PCR选用β-actin为内参照,以逆转录所得的cDNA为模检测各组标本IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达量.PCR反应条件是95℃预变性 5 min.反应条件为:95℃ 45 s,然后 59℃45 s,64℃50 s,72℃45 s,共22个循环后,延伸72℃10min.反应结束后,以18srRNA为内参照物,由电脑软件分析计算结果.对于样本总RNA浓度的差异,用最终目的基因的结果除以内参基因来校正.HMGB1引物设计由美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）GenBank数据库中获得基因序列,经primer Premier 5.0软件设计,由上海生工生物工程技术有限公司合成.序列如下: Sequence Name:IL-4F

IL-4F:5′-GGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3′

IL-4R:5′-GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT-3′102 bp

Sequence Name:IL-5F

IL-5F:5′-CTCTGTTGACAAGCAATGAGACG-3′

IL-5R:5′-TCTTCAGTATGTCTAGCCCCTG-3′102 bp

Sequence Name:IL-13F

IL-13F:5′-CCTGGCTCTTGCTTGCCTT-3′

IL-13R:5′-GGTCTTGTGTGATGTTGCTCA-3′106 bp

β-actin F:5′-GACGGGGTCACCCACACTGT-3′

β-actin F:5′-AGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′528 bp

1.3 统计学处理 采用SAS9.01统计软件进行分析.计量数据以表示.多组间均数比较采用x2检验.方差齐性时采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,方差不齐时用Welch校正.以P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 肺组织HE染色 肺组织HE染色后对比观察发现,哮喘组小鼠的支气管及肺间质周围被大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞所浸润,黏膜下层增宽,皱裙增多,管腔变狭窄,平滑肌层血管丰富且增厚.而对照组支气管上皮完整,无炎性表现,各组织形态正常（图1）.

图1 小鼠肺组织HE染色（×100）

2.2 肺组织IL-4、IL-5、IL-13 m RNA变化 IL-4、IL-5、IL-13各组之间比较结果均为哮喘组、开瑞坦组及吡嘧司特组均明显高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）.其中哮喘组又明显高于开瑞坦组及吡嘧司特组,而开瑞坦组与吡嘧司特组组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05,表1）.

表1 RT-PCR测定四组小鼠肺组织IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达比较 （n=1 0,x±s）

表1 RT-PCR测定四组小鼠肺组织IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表达比较 （n=1 0,x±s）

aP＜0.05 vs对照组;cP＜0.05 vs开瑞坦组及吡嘧司特组.

组别 IL-13 IL-5 IL-4哮喘组 0.943±0.199ac1.162±0.218ac1.449±0.398ac开瑞坦组 0.498±0.1358a0.450±0.068a0.450±0.125a吡嘧司特组 0.518±0.225a0.611±0.158a0.340±0.235a对照组 0.021±0.009 0.021±0.009 0.028±0.005

3 讨论

哮喘属于慢性气道炎症性疾病,目前,其发病原因及发病机制尚未研究透彻.大多数观点认为支气管哮喘与气道的水肿、黏液分泌及多种炎性介质的启动和放大有关［6-7］.而气道的慢性炎症,在炎症的反复刺激下,演变为呼吸道结构改变,造成气道重塑.许多研究表明,辅助T细胞的平衡失调与哮喘密切相关,特别是Th2细胞,其在哮喘发病中占主要地位,它的优势分化和产生的细胞因子在炎症部位高表达.原因是气道炎症时,Th2细胞功能亢进,抗原进入体内后细胞被激活,开始大量分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子［8-10］.这些因子进一步激活B细胞,合成特异性的IgE,使得体内的变态反应加剧［11］.为此,本研究通过观察吡嘧司特在哮喘小鼠肺组织中的IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-13mRNA细胞因子的表达,分析其在哮喘治疗中的效果.

IL-4、IL-5及IL-13具有很强的促炎症作用,并与多种自身免疫病的发生、发展有关.IL-4是诱导炎症反应的早期启动因素,是合成IgE细胞因子的网络控制中心,主要通过加强嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的活性来起到炎性作用.IL-5则可以促进原始的Th细胞分化成Th17细胞,加强嗜酸性粒细胞的聚集,诱导炎性反应［12-14］.而IL-13是作为一种效应细胞因子, 在T淋巴细胞活化和促进中有显著作用,是由Th2细胞产生的代表性细胞因子之一［15］.目前,哮喘的治疗仍然以药物治疗为主,其中激素、茶碱、β2-受体激动剂等药物的使用不仅副作用明显,且全身或局部的不良反应给患者的生活质量造成严重影响［16］.为此,本研究中所使用的吡嘧司特,是一种新的过敏介质阻释剂.在肺组织、外周血、腹膜等组织中,吡嘧司特能抑制抗原-抗体反应,激活因子降低 IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-13mRNA的表达.同时吡嘧司特还能抑制白细胞外Ca2+内流及细胞内Ca2+的释放,降低Ⅰ型变态反应介导的过敏［17］.研究结果显示,哮喘组、开瑞坦组及吡嘧司特组小鼠在致敏后出现抓鼻、呼吸频率加快、点头呼吸、步态不稳等症状.病理学检查显示哮喘小鼠的支气管及肺间质周围被大量炎性细胞所浸润,出现水肿.而3组小鼠的肺部组织中IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13 mRNA水平明显高于对照组,在经过开瑞坦及吡嘧司特治疗4周后,肺部组织中IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-13mRNA水平明显降低,与哮喘组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明两种药物治疗对哮喘是有效的.吡嘧司特在降低小鼠Th2细胞因子水平、纠正平衡失衡、抑制气道黏液分泌、保护气道不受炎性细胞浸润等方面作用明显.

综上所述,本研究结果表明哮喘模型小鼠肺部炎症是由多种细胞因子、炎症介质引起的病理过程,通过相互重叠、相互促进和相互抑制使得疾病难以治愈.吡嘧司特在哮喘小鼠治疗中,可以通过下调IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA的表达来发挥作用,且治疗效果明显,在急性期治疗作用突出,是一种有效的控制和治疗哮喘的药物,为支气管哮喘的治疗提供了新的思路.

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The effect of pem irolast on IL-4mRNA, IL-5mRNA and IL-13m RNA expression in lung tissue of asthm atic m ice

MAO Shun
Fifth People's Hospital of Changshu,Changshu 215500,China

【Abstract】AIM:To study the effect of orally adminstrated Pemirolast on expression of IL-4mRNA, IL-5mRNA and IL-13mRNA in lung tissue of asthmaticmousemodel and provide help and guidance for clinical treatment.METHODS:A total of 40male BALB/C and specific pathogen freemice were randomly divided into control group,asthma group,Claritin group and Pemirolast group,witn 10 mice in each group.Asthma group, Claritin group and Pemirolast group established mouse asthma model by ovalbumin（OVA,Grade V）,while control group used saline instead of OVA.The asthma model mice in Claritin and Pemirolast group were fed with Claritin and Pemirolast for four weeks continuously and expression levels of IL-4mRNA, IL-5mRNA and IL-13mRNA in lung tissue were detect by RT-PCR.RESULTS:The expression of IL-4mRNA,IL-5mRNA and IL-13mRNA in lung tissue of control group was low but was significantly high in asthmatic group with statistically significant difference（P＜0.05）.The expression of IL-4mRNA,IL-5mRNA and IL-13mRNA were inhibited in Claritin and Pem irolast group and difference of treatment efficacy between Claritin and Pemirolast group was not statisticatty significant（P＞0.05）.CONCLUSION:Pem irolast possibly plays a role in the treatment of asthma by reducing IL-4mRNA,IL-5mRNA and IL-13mRNA expression and has evident effects in acute stage.

【Keywords】pemirolast;claritin;asthma;expression of inflammatory cytokines

【中图分类号】R392.5;R256.12

【文献标识码】A

文章编号:2095-6894（2015）07-001-03

收稿日期:2015-04-25;接受日期:2015-05-10

作者简介:毛 顺.本科,主治医师.研究方向:呼吸内科. E-mail: jscsms@163.com