骨碎补不同炮制品化学成分的差异研究

陶 益，蒋妍慧，李伟东，蔡宝昌

（南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

骨碎补不同炮制品化学成分的差异研究

陶 益，蒋妍慧，李伟东，蔡宝昌

（南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

目的 比较骨碎补烫品、酒品、盐品化学成分的差异。方法 按照中国药典2010版标准，测定骨碎补不同炮制品的水分、总灰分、醇溶性浸出物，并建立HPLC方法，比较骨碎补不同炮制品主要化学成分的差异，考察方法的线性、精密度、稳定性、重复性及加样回收率，同时使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）对骨碎补不同炮制品的主要差异化学成分进行定性。结果 骨碎补炮制品的水分、总灰分、醇溶性浸出物测定结果均符合《中国药典（2010年版）》的要求。运用质谱法鉴定了8个主要差异化学成分。结论 骨碎补经炮制后柚皮苷含量变化不大，但是其他主要成分的含量发生了较大的变化，这可能是不同炮制品临床功效存在差异的主要原因。

骨碎补/化学； 骨碎补/生产和制备； 炮制/方法； 色谱法，高压液相； 砂烫； 酒品； 盐品

骨碎补为水龙骨科植物槲蕨[Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.]的干燥根茎，其主要功能为疗伤止痛、补肾强骨，多用于跌扑闪挫、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨萎软、耳鸣耳聋、牙齿松动等[1-2]。目前，2010版《中国药典》收录 2种规格，即骨碎补和烫骨碎补。除了药典收载的烫制法，历代炮制文献中还记载着蜜制、姜制、盐制、酒制、炭制、蒸制等法炮制骨碎补，譬如宋代《圣济总录》记载：“去毛，一两剉以盐水半两同炒令黄，去盐不用。”又如宋代《太平惠民和剂局方》记载：“凡使，用刀刮去上黄皮毛令尽，细剉，用酒拌蒸一日，取出晒干用”[3]。骨碎补历代炮制方法繁多，目前尚鲜有炮制前后系统性的研究报道。本研究按照2010版《中国药典》附录ⅡD炮制通则项下要求，分别炮制得到骨碎补烫品、盐品和酒品，并根据药典中的质量标准，比较骨碎补不同炮制品各项质控指标的差异，同时采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）对骨碎补不同炮制品中差异成分进行定性分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Agilent1100高效液相色谱仪包括Agilent1100色谱工作站、紫外-可见光二极管阵列检测器和自动进样器（安捷伦公司）；Shimadzu色谱系统，QTOF 5600-plus质谱仪（AB Sciex公司），Ultra Pure纯水仪（上海旦鼎国际贸易有限公司）；扁形称量瓶，蒸发皿，BT125型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），Buchi R-205型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司），打粉机，DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。柚皮苷对照品（四川维克奇生物技术有限公司，批号：140721），纯度大于或等于98%。甲酸为分析纯。骨碎补药材在四川省收集，经蔡宝昌教授鉴定为水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎。食盐购于江苏省盐业集团有限责任公司，黄酒购于绍兴女儿红酿酒有限公司。

1.2 方法

1.2.1 饮片制备 烫骨碎补：取净骨碎补或片，用砂烫至鼓起，撞去毛，得烫骨碎补备用；酒骨碎补：取净骨碎补或片，加黄酒拌匀，每100千克待炮制品用黄酒20 kg闷透，置炒制容器内，用文火炒至鼓起，取出，放凉，得酒骨碎补备用；盐骨碎补：取净骨碎补或片，加盐水拌匀，每100千克待炮制品用食盐2 kg闷透，置炒制容器内，以文火加热，炒至鼓起，取出，放凉，得盐骨碎补。

1.2.2 样品溶液制备 精密称取柚皮苷对照品0.5 mg，加甲醇1 mL，配制成浓度为0.5 g/L溶液，依次稀释成浓度为 0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 g/L的对照品溶液，备用。按照《中国药典（2010版）》规定，药材粉碎后，取本品粉末0.25 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇30mL，加热回流3 h，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 药典项目检查 采用烘干法对骨碎补生品、烫品、盐品、酒品中的水分进行检查，采用总灰分测定法对骨碎补生品和不同炮制品的总灰分进行检查，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定骨碎补生品和不同炮制品的浸出物。柚皮苷定量的液相色谱条件：Xbridge C18色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；流速1.0 mL/min；柚皮苷和炮制品提取物的液相分析条件：0 min，5%B；35 min，65%B；检测波长283 nm；柱温30℃；进样量10 μL。

1.2.4 液质联用分析 UHPLC-Q-TOF/MS条件：Kromasil C18column（150.0 mm×4.6mm，5 μm，流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度：0min，5%乙腈；5min，10%乙腈；10 min，20%乙腈；20 min，50%乙腈；分析时间：30 min，流速：0.6 mL/min，柱温：30℃，进样体积：5 μL。质谱条件：扫描模式为负离子模式，毛细管温度为325℃，离子源电压为-4.5 kV，喷雾气压为55 psi（1 psi=6.895kPa），去簇电压为-60 V，加热气压为55 psi，离子源温度为550℃，一级质谱扫描范围为质荷比（m/z）100～1 500，二级质谱激活类型为碰撞诱导解离（CID）。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 线性关系考察 精密吸取10 μL不同浓度的柚皮苷对照品溶液进样，记录色谱峰，以柚皮苷对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.2.5.2 精密度试验 取柚皮苷对照品溶液连续进样6次，记录色谱峰峰面积，计算其峰面积相对标准偏差（RSD）。

1.2.5.3 稳定性试验 精密称取骨碎补粉末，共6份，每份0.25 g，按1.2.2方法制备供试品溶液，再按前述色谱条件试验，分别进样10 μL，记录色谱图，计算柚皮苷峰面积RSD值。

1.2.5.4 重复性试验 精密称取骨碎补粉末，共6份，每份0.25 g，按1.2.2方法制备供试品溶液，再按前述色谱条件试验，分别进样10 μL，记录色谱图，计算柚皮苷峰面积RSD值。

1.2.5.5 回收率试验 采取加样回收法，取6份已知含量的同一批次样品约0.25 g，精密称定，分别按照1∶1精密加入柚皮苷对照品，按1.2.2方法制备供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液10 μL，注入色谱仪，依法测定回收率，计算RSD值。

1.2.5.6 含量测定 精密吸取骨碎补生品和不同炮制品供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按前述色谱的条件进样分析，记录色谱图。记录每个色谱峰的峰面积，采用面积归一化法计算供试品中柚皮苷（图1峰8）含量，得出骨碎补和烫骨碎补中柚皮苷含量（2010版药典要求为大于0.50%）。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 药典检查项目结果比较 根据药典要求生品水分不得超过15%，烫品水分不得过14%，生品灰分不得超过8%，烫品灰分不得超过7%，生品和烫品醇溶物含量均应超过16%，骨碎补生品和烫品检查结果符合药典要求（骨碎补盐品和酒品目前未被药典收载，也无统一的质量标准）。与生品比较，盐品的水分含量较高，而酒品的水分含量较低；盐品和酒品的总灰分远远低于生品；酒品和盐品的醇溶性浸出物显著高于生品。见表1、图1。

表1 骨碎补不同炮制品药典指标比较（±s表，%，n=3）

表1 骨碎补不同炮制品药典指标比较（±s表，%，n=3）

样品生品烫品盐品酒品水分 总灰分 醇溶性浸出物10.29±0.95 6.24±0.29 13.20±0.10 7.87±0.06 7.11±0.12 4.57±0.14 4.82±0.07 4.27±0.07 37.00±8.88 49.17±0.14 49.02±0.21 59.68±9.20

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系考察 回归方程Y=19 089X+24.166（R2= 0.999 5，n=6），结果表明，柚皮苷在0.031 25～0.500 00 g/L呈良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 连续进样6次，柚皮苷色谱峰峰面积RSD值为1.69%。

2.2.3 稳定性试验 柚皮苷峰面积RSD值为1.72%，表明重复性良好。

2.2.4 重复性试验 柚皮苷峰面积RSD值为1.72%，表明重复性良好。

2.2.5 回收率试验 回收率为100.29%，RSD值为2.44%。

2.2.6 含量测定 骨碎补和烫骨碎补中柚皮苷含量分别为1.57%和1.63%，符合《中国药典（2010年版）》要求（＞0.50%）。虽然骨碎补盐品和酒品无药典标准，但二者柚皮苷含量分别为1.78%和2.05%，均达到药典要求。

图1 药骨碎补不同炮制品化学成分比较

2.3 差异化学成分的高分辨质谱表征 骨峰1的[M-H]-为341.0889，分子式为C15H18O9，主要二级碎片为m/z 179和m/z 135，前者为化合物1失去一个相对分子质量为162的六碳糖基所产生，通过与文献[4]比较，推断化合物1为1-咖啡酰葡萄糖苷。峰2的[M-H]-为305.064 2，分子式为C15H14O7，主要二级碎片为m/z 167和m/z 125，通过与文献[5]比较，推断化合物2为表没食子儿茶素。峰3的[M-H]-为239.056 9，分子式为C11H12O6，主要二级碎片为m/z 177和m/z 149，通过与文献[5]比较，推断化合物3为4-乙酰基-3，5-二甲氧基苯甲酸。峰4的[M-H]-为449.1092，分子式为C21H22O11，主要二级碎片为m/z287，是化合物4失去1个相对分子质量为162的六碳糖基产生的，通过与文献[6]比较，推断化合物4为北美圣草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。峰5的[M-H]-为595.167 0，分子式为C27H32O15，主要二级碎片为m/z 459.114 6，通过与文献[7]比较，推断化合物5为新北美圣草苷。化合物6和化合物5的一级和二级质谱一致，保留时间也相近，2个化合物可能是同分异构体，通过与文献[7]比较，推断化合物6为圣草次苷。峰7的[M-H]-为625.156 9，分子式为C31H30O14，主要二级碎片为m/z 353和m/z191，通过与文献[8]比较，推断化合物7为北美圣草素-7-O-[6′′-（3′′′-羟基-4′′′-甲氧基肉桂酰）-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物8的[M-H]-为579.172 6，分子式为C27H32O14，通过与对照品及文献[5]比较，确定为柚皮苷。骨碎补的高分辨质谱总离子流图见图3。

图3 骨碎补的质谱总离子流图

3 讨 论

骨碎补的主要化学成分为酚酸和黄酮类成分，柚皮苷是药典规定的主要质控指标，能够促进骨质修复愈合[9-11]。骨碎补经炮制后柚皮苷含量变化不大，但是其他主要化学成分如1-咖啡酰葡萄糖苷、表没食子儿茶素、新北美圣草苷和圣草次苷等含量发生了较大变化，这些可能是骨碎补不同炮制品临床功效存在差异的主要原因。与生品比较，烫品和盐品中的1-咖啡酰葡萄糖苷和表没食子儿茶素均显著降低，这可能和这2种化合物在高温条件下不稳定，容易发生降解有关。3种炮制品中的新北美圣草苷含量显著降低，而圣草次苷含量显著升高，这可能与新北美圣草苷和圣草次苷存在互变异构有关。此外，本研究所建立的HPLC方法具有良好的线性、精密度、准确度，回收率也符合要求，可以应用于骨碎补不同炮制品中主要成分的质控。

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Investigation on differences in chemical constituents of different processed products of Drynaria fortunei

Tao Yi，Jiang Yanhui，Li Weidong，Cai Baochang
（College of Pharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu 210023，China）

Objective To compare the differences in chemical components of scalding product，wine product and salt product of Drynaria fortunei.Methods The water content，total ash，alcohol-soluble extract of different processed products of Drynaria fortunei were detected according to the criteria in the Chinese Pharmacopoeia 2010 version.The HPLC method was established to compare the differences in the major chemical constituents of different processed products of Drynaria fortunei.The linearity，precision，stability，repeatability and recovery rate of the method were investigated.Meanwhile，ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/time of flightmass spectrometry（UHPLC-QTOF-MS/MS）was also employed to qualitatively identify the major different chemical constituents of different Drynaria fortunei processed products.Results The detection results of water content，total ash，alcohol-soluble extract of Drynaria fortunei processed products were in line with the requirements of the Chinese Pharmacopoeia（2010 edition）.Meanwhile the mass spectrographic method was used to identify 8 main different chemical constituents.Conclusion After processing，the content of naringin in Drynaria fortunei has little change，while the content of other majorconstituentsarechangedsignificantly，whichmayberesponsibleforthedifferentclinicalefficacyofdifferentprocessedproducts.

Drynaria fortunei/chemistry； Drynaria fortunei/Sheng chan he zhi bei； Processing（TCD）/methods；Chromatography，high pressure liquid； Heated with sand； Wine-processed； Salt-processed

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.008

A

1009-5519（2015）23-3549-03

2015-10-02）

江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20140963）；科技部国家科技重大专项资助项目（2012ZX09304005）。

陶益（1985-），男，浙江台州人，助理研究员，主要从事中药炮制学的研究；E-mail：taoyi1985812@126.com。