Annexin A5、FOXP3基因与中国汉族女性卵巢早衰的相关性分析

陈蓓丽，周思睿，胡 平，王 晶，邹薇薇，王彬彬，曹云霞

（1.安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心，安徽合肥230022；2.国家卫生计生委科学技术研究所，北京100081）

Annexin A5、FOXP3基因与中国汉族女性卵巢早衰的相关性分析

陈蓓丽1，周思睿2，胡 平1，王 晶2，邹薇薇1，王彬彬2，曹云霞1

（1.安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心，安徽合肥230022；2.国家卫生计生委科学技术研究所，北京100081）

目的 探讨中国汉族女性中膜联蛋白A5（Annexin A5）基因、叉头样转录因子3（FOXP3）基因多态性与卵巢早衰（POF）之间的关系。方法 在2007年12月至2014年12月来该院就诊的中国汉族女性人群中选取POF患者100例（观察组）和健康女性140例（对照组），挑选能够覆盖Annexin A5全基因的4个标签单核苷酸多态性（Tag SNPs）（rs2306420、rs6857766、rs2306415、rs1383232），FOXP3基因的2个Tag SNPs（rs3761548、rs3761549）作为检测指标，采用对照研究方法，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）检测Annexin A5、FOXP3基因型和等位基因在两组人群中的分布情况。结果 Annexin A5基因的4个Tag SNPs及FOXP3的2个Tag SNPs基因型和等位基因在POF观察组及对照组的频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05），且Annexin A5基因各位点所能构成的单体型，差异无统计学意义（P＞0.05）。FOXP3基因rs3761548、rs3761549所构成的单体型中AC单体型在观察组和对照组中的分布情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 该研究排除了Annexin A5基因作为中国汉族女性POF易感基因的可能性，而FOXP3基因AC单体型（rs3761548、rs3761549）人群POF的发生率可能会升高。

膜联蛋白A5； 基因型； 汉族； 卵巢； 等位基因； 多态性，单核苷酸

卵巢是具有独特发育周期的内分泌结构，卵泡周期性的更新换代保证和维持了女性的生殖健康和生活质量。原始卵泡池内的卵泡数量生成减少，凋亡闭锁增加均会引起卵巢功能不全进而发生卵巢早衰（premature premature ovarian failure，POF），即妇女40岁前发生过早绝经的现象。膜联蛋白A5（Annexin A5）是一种钙磷脂结合蛋白，膜联蛋白家族广泛存在于组织细胞中，参与炎性反应、信号传导、细胞骨架活动，以及肿瘤细胞增殖、分化与凋亡。近年来，对Annexin A5基因与妇科肿瘤如宫颈癌[1]、子宫内膜癌及妇科内分泌疾病如多囊卵巢综合征的研究逐渐增多。叉头样转录因子（FOXP3）是Forkhead转录因子家族的重要成员，在维持自身免疫耐受、预防自身免疫疾病方面扮演着重要角色。FOXP3基因的失活突变会引起免疫功能失调、多发内分泌病及肠病等一系列征候群[2]。免疫功能的异常也有可能引起POF的发生。因此，本研究试图通过检测基因多态性来探讨中国汉族女性中AnnexinA5基因、FOXP3基因与POF之间的关系。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2007年12月至2014年12月在本院生殖中心就诊的100例POF女性患者作为观察组，年龄16～40岁，平均（30.40±6.51）岁；月经初潮平均年龄（14.50±1.98）岁，闭经时平均年龄（25.9±6.90）岁。选择同期在本院就诊的月经周期规则、性激素检查在正常范围内、无卵巢相关疾病的健康女性140例作为对照组，年龄21～44岁，平均（31.20±4.50）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。所有研究对象对本研究知情同意，并签订知情同意书，本研究经医院伦理道德委员会审查批准。

1.1.2 诊断标准 纳入标准：（1）年龄40岁以下的中国汉族女性原发或继发性闭经3～6个月以上；（2）激素检测：于月经第3～5天检测血清促卵泡生成素（folliclestimulating hormone，FSH），至少间隔1个月重复测量大于30 U/L[3]。排除标准：（1）染色体异常；（2）通过详细的病史询问、妇科检查、体格检查及超声检测等排除盆腔创伤史、手术史、放化疗史及其他妇科内分泌疾病史等。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 采集符合诊断标准的POF患者及对照人群血样标本约5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管内，分装后立即于-80℃冰箱内冷冻保存。

1.2.2 DNA提取 使用血液基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司），采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统进行DNA抽提。提取后的DNA样本经NanoDrop2000超微量分光光度计质控，调整所有样品的DNA浓度至5～10 ng/μL。

1.2.3 标签单核苷酸多态性（Tag SNPs）的选择 使用HapMap Database/Haploview软件，根据Pair-wise方法查找Annexin A5、FOXP3基因的Tag SNPs（以代表整个基因全部SNP），查询该SNP位点前后各150 bp的序列信息，利用Sequenom网站（http：//www.sequenom.com/iplex）确定各SNP相关性，以及是否各相对分子质量能够被设计进同一孔中。Annexin A5的4个Tag SNPs为rs2306420、 rs6857766、rs2306415、rs1383232；FOXP3的2个 Tag SNPs为rs3761548、rs3761549。

1.2.4 PCR引物及反应体系设计 利用 Sequenom MassARRAY®相对分子质量阵列平台的iPLEX GOLD技术，根据待测SNP位点的信息设计PCR引物和反应体系。引物包括1对PCR扩增引物及1条延伸引物。Annexin-a5、FOXP3基因的引物设计结果见表1。

1.2.5 基因多态性检测 采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）对挑选的6个Tag SNPs进行检测，最终数据由MassARRAY软件系统实时收集并统计基因型和等位基因的频率分布。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行相关数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验（理论频数小于1时使用Fisher精确检验法）；利用SHEsis在线软件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）进行基因内Tag SNPs的单体型分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 Annexin A5、FOXP3基因Tag SNPs的PCR扩增引物序列

2 结 果

2.1 基因型和等位基因的频率分布 收集数据并进行整理，结果显示6个Tag SNPs均满足Hardy-Weinberg平衡。

2.1.1 Annexin A5基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的频率分布 覆盖Annexin A5基因的4个Tag SNPs结果如下：rs2306420（C/T）有3种基因型，其频率分别为：CC（73.7%）、TT（1.0%）、CT（25.3%）；rs6857766（A/G）有3种基因型，其频率分别为：AA（0.0%）、GG（77.0%）、AG（23.0%）；rs2306415（C/G）有3种基因型，其频率分别为：CC（66.3%）、GG（3.1%）、CG（30.6%）；rs1383232（A/G）有3种基因型，其频率分别为：AA（4.2%）、GG（55.2%）、AG（40.6%）。经统计分析，其基因型及等位基因在POF观察组及对照组的频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.1.2 FOXP3基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的频率分布 覆盖FOXP3基因的2个Tag SNPs结果如下：rs3761548（A/C）有3种基因型，其频率分别为：AA（7.1%）、CC（58.2%）、AC（34.7%）；rs3761549（C/T）有 3种基因型，其频率分别为：CC（71.9%）、TT（0）、CT（28.1%）。经统计分析，其基因型及等位基因在POF观察组及对照组的频率分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.2 AnnexinA5基因形成的单体型关系 经分析，Annexin A5基因的 4个 Tag SNPs中 rs2306420和rs2306415不在同一个block中，由另外2个位点rs1383232和rs6857766所构成的单体型共有3种，但是两组各单体型分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 Annexin A5基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的频率分布（%）

表3 FOXP3基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的频率分布（%）

表4 Annexin A5基因形成的单体型关系（%）

2.3 FOXP3基因形成的单体型关系 FOXP3基因的rs3761548、rs3761549所构成的单体型共有4种，AC单体型在观察组和对照组中的分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05），会增加POF的发生风险。见表5。

表5 FOXP3基因形成的单体型关系（%）

3 讨 论

POF是妇科疾病中的疑难病症之一，严重影响妇女的生殖健康和生活质量。育龄妇女POF发病率约1%～3%[4]，近年来有逐渐上升趋势。究其病因，异质性程度高，排除常见的染色体异常、免疫、手术、放疗、化疗、创伤、感染及代谢等因素外，仍有相当大比例病因不明。有研究表明，遗传因素是POF的一个重要原因，特发性POF主要是由多基因遗传及环境因素共同作用引起的复杂疾病[5]。

Annexin A5基因位于人类染色体4q27，全长29kb，共包含13个外显子。既往研究提示其特殊的分子结构酸性磷脂决定其在参与抗凝、炎性反应及细胞凋亡等过程中发挥重要作用[6]。AnnexinA5能够在细胞膜上形成侧向聚集物，以激发其在胎盘绒毛上的防御功能，从而发挥抗凝作用[7]。复发性流产患者中血栓形成倾向异常，因此，AnnexinA5 M2单体型一直是该病的研究热点。Demetriou等[8]研究显示，在自发性流产患者中Annexin A5 M2等位基因的频率显著高于对照组。另有研究指出，多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者循环中的AnnexinA5阳性的血小板浓度较对照组升高，可能与PCOS的代谢异常、心血管疾病的发生相关[9]。耿蔷等[10]推测，卵丘细胞表达的Annexin A5可能是一种潜在的卵母细胞成熟相关蛋白。卵丘细胞中Annexin A5的表达，随着卵母细胞的成熟，卵丘细胞中Annexin A5的表达上调。推测Annexin A5蛋白表达水平的变化可能与体内LH峰的作用有关，并可能与LH峰伴随的卵丘膨胀、卵丘细胞的活跃增殖与代谢、细胞外基质的黏附、卵丘细胞内钙离子浓度波动等生物过程有关[10]。

POF的本质是卵巢功能提前衰竭，卵子数量生成减少、凋亡增加、成熟障碍都可能引起卵子发育的异常，从而引起女性的生育力下降甚至缺失。推测Annexin A5基因可能通过参与抗凝或炎症过程的调节从而引起卵巢功能的异常，通过参与调节凋亡和成熟过程而影响卵子的生长发育。因此，本研究试图探寻Annexin A5基因与POF发病之间是否存在相关性。结果显示，覆盖整个Annexin A5基因的Tag SNPs的基因型和等位基因在观察组和对照组中的频率分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。两组研究对象4个Tag SNPs所构成的单体型分布差异也无统计学意义（P＞0.05）。因此，在对Annexin A5基因与POF进行的首次关联分析中，作者排除了Annexin A5基因作为中国汉族女性POF易感基因的可能性。

1968年，Irwine提出POF的发生可能与自身免疫系统功能异常相关。Silva等[11]研究表明，约20%的POF患者曾经有自身免疫疾病的病史，如甲状腺功能异常、系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血等。FOXP3作为CD4+CD25+调节T（Treg）细胞表面的特征性标志，是Treg细胞发育和功能维持的关键因素，在自身免疫疾病的发生中发挥重要作用。本研究在POF人群中筛查FOXP3基因的多态性并进行相关性分析，尽管两组研究对象覆盖FOXP3基因的2个Tag SNPs位点的等位基因频率和基因型频率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），但由这2个位点所构成的单体型AC在观察组中的分布明显高于对照组，因此推测AC单体型相较于其他单体型人群POF的发生风险增大。

综上所述，本研究选择标签SNPs作为检测指标，利用MALDI-TOF MS对Annexin A5、FOXP3基因的基因型和等位基因，以及Block区内各SNP所能构成的单体型在观察组和对照组中的频率分布进行分析，并首次对这2个基因与POF之间的关联进行研究。排除了Annexin A5基因作为POF易感基因的可能性，提示FOXP3基因可能与POF的发生相关，但该结果仍需进一步扩大样本量并在不同的人种中进一步验证。

[1]李欣，高福禄.膜联蛋白A5在宫颈癌细胞系中的表达[J].承德医学院学报，2008，25（1）：12-13.

[2]Katoh H，Zheng P，Liu Y.FOXP3：genetic and epigenetic implications for autoimmunity[J].J Autoimmun，2013，41：72-78.

[3]Cox L，Liu JH.Primary ovarian insufficiency：an update[J].Int J Womens Health，2014，20（6）：235-243.

[4]Luborsky JL，Meyer P，Sowers MF，et al.Premature menopause in a multiethnic population study of the menopause transition[J].Hum Reprod，2003，18（1）：199-206.

[5]Persani L，Rossetti R，Cacciatore C.Genes involved in human premature ovarian failure[J].J Mol Endocrinol，2010，45（5）：257-279.

[6]高丕尧，高枫，甘嘉亮.Annexin-a5在相关疾病中作用机制的研究进展[J].基础医学与临床，2015，35（1）：104-107.

[7]Bouter A，Gounou C，Bérat R，et al.Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair[J].Nat Commun，2011，2：270.

[8]Demetriou C，Abu-Amero S，White S，et al.Investigation of the Annexin-A5 M2 haplotype in 500 white European couples who have experienced recurrent spontaneous abortion[J].Reprod Biomed Online，2015，31（5）：681-688.

[9]Willis GR，Connolly K，Ladell K，et al.Young women with polycystic ovary syndrome have raised levels of circulating annexin V-positive platelet microparticles[J].Hum Reprod，2014，29（12）：2756-2763.

[10]耿蔷.利用蛋白质组学方法寻找人卵丘细胞中的卵母细胞成熟相关蛋白[D].广州：南方医科大学，2011.

[11]Silva CA，Yamakami LY，Aikawa NE，et al.Autoimmune primary ovarian insufficiency[J].Autoimmun Rev，2014，13（4/5）：427-430.

Analysis on correlation between Annexin A5，FOXP3 genes and idiopathic premature ovarian failure in Chinese Han females

Chen Beili，Zhou Sirui，Hu Ping，Wang Jing，Zou Weiwei，Wang Binbin，Cao Yunxia
（1.Reproductive Medicine Center，Department of Gycocolegy and Obstetrics，First Affiliated Hospital，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China；2. Scientific and Technical Research Institute of National Health and Family Planning Commission，Beijing 100081，China）

Objective To investigate the correlation between the polymorphisms of Annexin A5 and FOXP3 genes with the premature ovarian failure（POF）in Chinese Han females.Methods Among 100 Han female cases（observation group）of POF in our hospital from December 2007 to December 2014 and 140 healthy females（control group），4 tag SNPs（rs2306420，rs6857766，rs2306415，rs1383232）covering the entire sequence of the gene Annexin A5 and 2 tag SNPs（rs3761548 and rs3761549）of gene FOXP3 were selected as the detection indicators.The case-control research method was adopted.The matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）was used to detect the distribution situation of Annexin A5 and FOXP3 genotypes and allele in the two groups.Results No statistically significant difference was found in the distributions of genotypes and alleles for 4 tag SNPs of gene Annexin A5 and 2 Tag SNPs of FOXP3 gene between the observation group and control group（P＞0.05）.Moreover the haplotype constituted by various loci of Annexin A5 gene had no statistical difference（P＞0.05）. The haplotype constituted by FOXP3 gene rs3761548 and rs3761549 in the observation group was significantly higher than that in the healthy control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion This research excludes the possibility of Annexin A5 gene as the POF susceptible gene in Chines Han females，however，the occurrence rate of POF may be increased in the female group with haplotype AC（rs3761548，rs3761549）of FOXP3 gene.

Annexin A5； Genotype； Han nationality； Ovary； Alleles； Polymorphism，single nucleotide

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.001

A

1009-5519（2015）23-3529-03

2015-09-20）

国家“973计划”项目（2014CB944704）；安徽医科大学第一附属医院青年基金项目（3101005002501）。

陈蓓丽（1985-），女，安徽淮北人，硕士研究生，主要从事生殖内分泌疾病相关研究工作；E-mail：cbl0118@126.com。

曹云霞（E-mail：caoyunxia6@126.com）。