不同pH 条件下测定藏药三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG 含量变化及分析

陈 平 左晓霜 华 杰 范 源

(1.云南中医学院，云南 昆明 650500;2.云南中医学院第一附属医院，云南 昆明 650500)

藏药三果汤，又称哲布松汤，由余甘子、诃子、毛诃子3味药组成。最早见于《四部医典》，记载三果汤“主治瘟疫、紊乱热症、促使热症成型”，即藏药三果汤主清热、调和气血，用于瘟疫热症初期和后期、劳累过度所诱发的疾病［1］。此外，现代研究表明按照阿育吠陀传统医学理论结合三果汤复方给药对治疗糖尿病有较好的效果［2-3］。在三果汤散处方配伍配比及用药剂量上，印度传统医药将诃子、毛诃子和余甘子3 种药材的比例确定为l：1：1，而藏医会根据临床不同情况而调整比例［4］。目前，药品消费市场已有三果汤口服液、三果汤胶囊、三果汤颗粒剂、三果汤散剂等剂改产品上市销售，对其处方制剂化学成分含量测定报道较少。三果汤中余甘子含有没食子酸、单宁酸和β-PGG，特别是没食子酸具有抗炎、抗菌等活性，与三果汤药理作用一致，成为三果汤制剂质控的有效指标之一［5］。张海伟等［6］对超声提取和回流提取进行比较，发现不同提取方法下没食子酸等的含量差异不大。本实验采用不同pH 磷酸缓冲液超声提取三果汤，运用RP -HPLC 测定藏药三果汤散中没食子酸、单宁酸、β -PGG 的含量，以期为藏药三果汤中成分的研究、药效学研究、质量控制等提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料：余甘子、毛诃子、诃子(购自安国市旭芳中药材经营有限公司)。乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，丙酮(分析纯)，乙醇(分析纯)，磷酸氢二钠(分析纯)，磷酸(分析纯)均购自云南丹赤贸易有限公司，纯化水。β -PGG 标准品(购自成都普瑞法科技开发有限公司，批号：14021908)，没食子酸(购自云南昆明中检所，批号：110831 -201204)，单宁酸标准品(购自成都迈斯g 医药科技有限公司，批号：130721)

Agilent1200 型高效液相色谱仪(VWD 检测器)、万分之一分析天平(购自北京赛多利斯仪器系统有限公司)、D2KW-D 电热恒温水浴锅、DFY - 600 摇摆式高速万能粉碎机、雷磁PHS-3C pH 计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 三果汤散的制备：依据卫生部颁藏药标准1995 版。诃子(去核)300g、毛诃子(去核)200g、余甘子(去核)240g分别打粉过3 号筛，混匀后过3 号筛，即得。

1.2.2 磷酸盐缓冲液的配制：A 液：取磷酸16.6 mL，加纯化水至1000 mL，摇匀。B 液：称取磷酸氢二钠71.63 g，加纯化水使溶解成1000 mL。取上述A 液72.5 mL 与B液27.5 mL 混合配制，摇匀，即得pH = 2.00 的缓冲液。以pH = 2 的缓冲液为基本底液，再用纯化水将其稀释成pH 为3、4、5、6 、7 的缓冲液。

1.2.3 没食子酸、单宁酸、β-PGG 对照品溶液的制备：精密称定没食子酸对照品0.10mg，用50%甲醇制成10μg/mL的溶液，备用。精密称取0.80 mg 单宁酸对照品，用乙醇、水、丙酮(70：29：1)溶液溶解并定容，制备成浓度为80μg/mL 的单宁酸标准溶液，备用。精密称定β -PGG 对照品1.00mg，用甲醇制成100μg/mL 的溶液，备用。

1.2.4 没食子酸、单宁酸、β-PGG 供试品溶液的制备：没食子酸、单宁酸供试品溶液的制备：精密称取0.1g 三果汤散，过3 号筛，置具塞锥形瓶中，分别制备6 份，精密加入不同pH 的磷酸缓冲液50mL，称定重量，超声30min(150W，40KHZ)，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm 滤膜过滤。即得。

β-PGG 供试品溶液的制备：精密称取0.1g 三果汤散，过3 号筛，置具塞锥形瓶中，分别制备6 份，精密加入不同pH 的磷酸缓冲液50mL，超声30min(150W，40KHZ)，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm 滤膜过滤。即得。

1.2.5 没食子酸含量测定方法

1.2.5.1 没食子酸色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 ×150 mm，5 μm);以甲醇-0.2%磷酸溶液(5：95)为流动相;检测波长为273 nm;柱温：25℃;进样量：10μL。

1.2.5.2 没食子酸线性关系考察：精密称取对照品0.10 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，摇匀作为储备液摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取3、5、7、9、11、13 μL 不同体积进样，以没食子酸的峰面积(Y)对标准品的质量(X)进行线性回归，得方程y =2080.6x-3.4868，r=0.9998，结果表明：没食子酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0.03 -0.130μg。

1.2.6 单宁酸含量测定方法

1.2.6.1 单宁酸色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 ×150 mm，5 μm);以甲醇-水(80：20)为流动相;检测波长为275 nm;柱温：25℃;进样量：2.0μL。

1.2.6.2 单宁酸线性关系考察：精密称取对照品0.60mg，用乙醇、水、丙酮(70：29：1)溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀作为储备液。按上述单宁酸色谱条件分别取1、3、5、7、9、11 μL 不同体积进样，以单宁酸的峰面积(Y)对标准品的质量(X)进行线性回归，得方程y =3232.8x-15.412，r =0.9999。结果表明：单宁酸峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为1.0 ～11.0μg。

1.2.7 β-PGG 含量测定方法

1.2.7.1 β-PGG 色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 ×150 mm，5 μm);流动相：0min：乙腈-0.1%磷酸(10：90)，15 min：乙腈-0.1%磷酸(25：75)，15.1 min：乙腈-0.1%磷酸(25：75)，20 min：乙腈-0.1%磷酸(25：75);检测波长为281 nm;柱温：25℃;进样量：20μL。

1.2.7.2 β -PGG 线性关系考察：精密称取对照品1.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，摇匀作为储备液摇匀作为储备液。按上述没食子酸色谱条件分别取13、15、17、19、21μL 不同体积进样，以β -PGG 的峰面积(Y)对标准品的质量(X)进行线性回归，得方程y =2195.0x -47.357，r=1.0。结果表明：PGG 峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为1.3 -2.1 μg。

2 实验结果与分析

2.1 实验数据：不同pH 条件下三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG 的含量：见表1、表2、表3。

图1 不同pH 条件下三果汤中没食子酸含量变化

图2 不同pH 条件下三果汤中单宁酸含量变化

图3 不同pH 条件下三果汤中β-PGG 含量变化

2.2 实验分析：当pH 等于3 时，藏药三果汤中没食子酸含量最高，pH 等于2 ～6 时三果汤中没食子酸含量变化不明显，pH 等于6 ～7 时，三果汤中没食子酸含量急剧下降到最低，如图1;当pH 等于3 时，三果汤中单宁酸含量最高，pH 等于3 ～7 时，三果汤中单宁酸含量呈先下降后上升的趋势，其中pH 等于5 时，单宁酸含量最低，如图2;当pH 等于2 ～5 时，三果汤中β-PGG 含量缓慢增长，当pH 等于5时，三果汤中β-PGG 含量最高，pH 等于5 ～7 时，三果汤中的β-PGG 含量明显下降，如图3。三果汤中没食子酸在pH 值为2 ～6 时含量变化较pH6 ～7 时含量变化小，推测没食子酸在中性条件下较不稳定，而对酸、强光、高温较稳定，在pH 值为2 ～6 的磷酸盐缓冲液条件下能保持相对稳定［7］。单宁酸是一类多酚类化合物，是没食子酸酯及其衍生物与葡萄糖或多酚通过酯键相连形成的化合物，遇酸、碱、酶能够水解，水解可生成双没食子酸酯等，能进一步水解可生产成没食子酸和葡萄糖等小分子化合物［8-9］。因此推测本实验中三果汤中的单宁酸在pH 等于5 时变化明显可能与单宁酸遇酸、碱水解成其他成分有关。本实验提示三果汤中β-PGG 含量较低，且酸碱条件对其影响不大。

3 结 论

本实验运用超声提取，研究分析不同pH 条件下测定三果汤中没食子酸、单宁酸、β -PGG 的含量变化，建立了相关测定方法。实验提示当pH 等于3 时，三果汤中没食子酸、单宁酸含量最高;pH 等于5 时，三果汤中β-PGG 含量最高。提示没食子酸、单宁酸、β-PGG，特别是没食子酸可作为藏药三果汤制剂相关质控指标之一，为藏药三果汤中化学成分研究、药效学研究及质量控制等提供一定参考。

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