响应面法优化葛根素提取工艺的研究

王 婴，伍艳芬

（广东药学院医药化工学院，广东中山528458）

响应面法优化葛根素提取工艺的研究

王 婴，伍艳芬

（广东药学院医药化工学院，广东中山528458）

目的优化葛根的提取工艺参数，提高葛根素的提取率。方法在单因素初筛的基础上，以HPLC测定的葛根素含量为响应值，进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，并利用Design Expert软件对试验数据进行分析，得到响应面数据并分析结果。结果乙醇浓度与提取时间、提取时间与料液比、乙醇浓度与料液比之间均存在着交互作用。葛根素的最优提取条件为乙醇浓度78%，提取时间为143 min，料液比为1∶10。结论优化的工艺提取条件简便，重现性良好，适用于葛根素的提取。

葛根素；中药制药工艺；工艺学；多元分析；乙醇

葛根为豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退热、生津止渴、通经活络等功效，用于治疗感冒发热、热痢、眩晕、头痛等症[1]。葛根中含有的异黄酮类成分具有降低心肌耗氧量、促进冠状动脉循环、缓解心绞痛等多种药理活性[2-4]。其中葛根素为主要有效成分，目前已有注射剂、片剂、胶囊等剂型上市，并成为临床治疗心脑血管病的一线用药[5-6]。为提高葛根素的产率，本研究采用响应面法对葛根素的提取工艺进行了优化，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 2489高效液相色谱仪（美国Waters公司）；

C18 ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ3200超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）；SHZ-DⅢ循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；FA2204B电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；TC-15恒温水浴锅（海宁市华星仪器厂）。

1.1.2 药物与试剂 葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；95%乙醇为分析纯；水为双蒸水；中药葛根购于广州致信药业有限公司，经广东药学院中药资源系曾令杰教授鉴定为豆科植物野葛的干燥根。

1.2 方法

1.2.1 葛根素含量测定方法的建立

1.2.1.1 色谱条件及系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（32∶68）为流动相；检测波长为250 nm；柱温为室温；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；理论板数按葛根素计算应不低于3 000[7-8]。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取葛根最粗粉15 g，按响应面设计1号提取方案，按料液比1∶10加入80%乙醇，加热回流2次，每次120 min，趁热滤过，合并滤液，减压浓缩至适量，转移至25 mL量瓶中，加80%乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.1.4 样品测定 分别精密吸取对照品与供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录图谱。

1.2.1.5 线性关系考察 精密吸取葛根素对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20 μL，测定峰面积，以峰面积Y为纵坐标，葛根素质量浓度X（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。

1.2.1.6 精密度试验 精密吸取浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液20 μL，连续进样6次，得葛根素峰面积的相对标准差（RSD）。

1.2.1.7 重复性试验 精密称取葛根最粗粉15 g，共取6份，按1.2.1.3项下方法分别制成供试品溶液。精密吸取20μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量的RSD。

1.2.1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8 h内，在1.2.1.1项色谱条件下测定，得葛根素峰面积的RSD。

1.2.1.9 回收率试验 精密吸取已知葛根素含量的供试品溶液6份，每份1mL，每份加入质量浓度为0.02mg/mL的对照品溶液3 mL，混匀后，精密吸取20 μL，在色谱条件下测定，得平均回收率及RSD。

1.2.2 响应面设计 在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken原理，以葛根素含量为响应值，对乙醇浓度、料液比及提取时间进行三因素三水平的试验设计，以确定葛根素提取的最佳工艺参数[9]。见表1。

表1 响应面设计因素水平表

1.2.3 模型拟合与响应面优化 通过Design Expert 7.0.0软件处理数据后，将响应值与各个因素进行回归拟合，得回归方程后，分别对其一次项、二次项和交互项进行方差分析，得出优选提取条件，并进行3批验证试验，以考察响应面结果的可靠性。

2 结 果

2.1 葛根HPLC色谱图 HPLC图谱显示，葛根素峰形尖锐，与其他成分分离情况良好。见图1。

图1 葛根HPLC色谱图

2.2 线性关系考察 回归方程为Y=9.7×107X-2.6×105，r=0.999 5，表明葛根素质量浓度在0.02～0.20 mg/mL线性关系良好。

2.3 精密度试验 葛根素峰面积的RSD为0.39%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验 葛根素含量的RSD为1.06%，表明该方法重现性良好。

2.5 稳定性试验 葛根素峰面积的RSD为1.02%，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.6 回收率试验 平均回收率为98.54%，RSD为0.86%，表明本法具有良好的准确度。见表2。

表2 回收率试验结果

2.7 模型拟合与响应面优化 回归方程为Y=2.92+ 0.36A+0.34B+0.33C+0.14AB+0.18AC-0.062BC-0.11A2-0.27B2-0.052C2（R2=0.986 9），方程因变量与自变量之间呈良好的线性关系（P＜0.01），表明该模型可以用于实际值的预测。响应面试验设计方案及结果见表3。乙醇浓度与提取时间的交互项、乙醇浓度与料液比、提取时间与料液比的交互项对葛根素含量有显著影响。葛根素的最优提取工艺条件是：乙醇浓度为78%，提取时间为143 min，料液比为1∶10，葛根素的最大含量预测值为4.522 mg。3批验证试验结果表明，葛根素平均含量为4.493%，与预测值相对误差小于1%，表明该模型与实际情况拟合良好，模型可靠。葛根素提取交互作用的三维曲面图见图2。

表3 响应面试验设计方案及结果

图2 葛根素提取交互作用的三维曲面图

3 讨 论

在预试验中，对提取次数、乙醇浓度、提取时间、料液比对葛根素含量的影响进行了单因素实验。结果表明，提取2次以上明显优于1次，而提取2次和3次没有明显区别，故提取次数确定为2次；乙醇浓度考察了50%、60%、70%、80%、90%，提取时间考察了30、60、90、120、150 min，料液比考察了1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12。结果表明，乙醇浓度在70%～90%、提取时间在90～150 min、料液在1∶8～1∶12内明显变化，由此确定了响应面法的取值范围。

近年来，响应面法逐渐应用于中药提取工艺的优化中，其最大优点在于可在充分减少实验次数的同时，对实验结果进行条件的细化，而不像正交试验那样只能从设定的水平中选点[10-12]。本文在单因素实验的基础上，以葛根素含量作为指标，采用Box-Behnken原理进行响应面试验设计，建立了乙醇加热回流法提取葛根素的拟合方程，筛选出葛根素的最优提取工艺，并对实验结果进行统计学分析，使提取工艺更加科学合理，为实际生产工艺的优化提供了实验基础。

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Study on response surface method for optimizing puerarin extraction process

Wang Ying，Wu Yanfen
（School of Pharmaceutical and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan，Guangdong 528458，China）

ObjectiveTo optimize the extraction technological parameters of Radix Puerariae in order to improve the extraction ratio of puerarin.MethodsBased on the single factor preliminary screening，with the puerarin content detected by HPLC as the response value，the three-factor and three-level Box-Behnken test design was carried on.The experimental data were analyzed by using the Design-Expert software.ResultsThe interaction action existed between the ethanol concentration and extraction time，between the extraction time and solid-liquid ratio and between the ethanol concentration and solid-liquid ratio.The optimal extraction conditions of puerarin were the ethanol concentration of 78%，the extraction time of 143 min and the solid to liquid ratio of 1∶10.ConclusionThe optimized technological extraction conditions are simple with good reproducibility and suitable for the extraction of puerarin.

Puerarin；Pharmaceutical technology；Technology；Multivariate analysis；Ethanol

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.007

A

1009-5519（2015）16-2426-03

2015-05-01）

王婴（1978-），女，江西南昌人，实验师，主要从事药物新剂型与质量控制研究工作；E-mail：yyxm799@126.com。