二丁酰环磷腺苷钠的制备及其含量和相关物质的测定

霍婷,孙凯,汪磊,李子健,郭盛强

(西安力邦医药科技有限责任公司，陕西 西安 710075)



二丁酰环磷腺苷钠的制备及其含量和相关物质的测定

霍婷,孙凯,汪磊,李子健,郭盛强

(西安力邦医药科技有限责任公司，陕西 西安 710075)

目的 制备二丁酰环磷腺苷钠并测定其含量及有关物质。方法 自制二丁酰环磷腺苷钠后，采用高效液相色谱法测定其含量和有关物质，色谱条件为：ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.05 mol/mL磷酸二氢钾溶液(25:75)为流动相，流速1 mL/min，273 nm为检测波长。结果 二丁酰环磷腺苷钠为白色粉末状固体(收率>70%，HPLC>99%)；含量测定线性范围为20～30 μg/mL，r=0.9997；重复性良好(RSD=0.4%，n=6)；回收率为101.2%(RSD=0.3%)；有关物质定量限为50.08 ng/mL，该浓度下检测结果稳定；线性范围为0.05～3.75 μg/mL，r=0.9999；重复性良好(RSD=4.53%，n=6)；回收率为93.5%(RSD=1.8%)。 结论 该合成路线简单，制备得到二丁酰环磷腺苷钠纯度高，建立的HPLC法测定其含量及有关物质简便，结果可靠。

二丁酰环磷腺苷钠；制备；含量；高效液相色谱法；有关物质

环腺苷酸(adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate，cAMP)是生长激素、肾上腺素等多种激素作用的第二信使，是动物机体代谢的重要调节因子。有资料显示它对心绞痛、急性心肌梗塞、牛皮癣有特效[1]。通过化学方法对cAMP的结构进行改造，在分子中加入两个丁酰基，使其具有较好的脂溶性，克服了cAMP使用上的局限性，可通过细胞膜在细胞内发挥作用[2]，在细胞内转变成cAMP，激活蛋白磷酸化酶，增强心肌功能，改善外周血管循环，解除休克时胰岛素分泌的抑制，促进组织对糖的摄取，改善能量代谢；还能对抗机体内磷酸二酯酶的降解作用，作用时间较为持久和迅速，因此具有更广阔的应用前景。为此，本文研究合成了一种新型cAMP的衍生物—二丁酰环磷腺苷钠(dbcAMP-Na)，该物质合成方法文献报道较多的是由cAMP经三乙胺盐保护、吡啶作溶剂酰化后成盐而成[3-5],本文采用方法将cAMP先制备成钠盐，然后以正丁酐既做反应物又做溶剂酰化得到目标产物，该法具有合成步骤少，产品纯度高等优点。同时，参考已有报道的钙盐有关文献[6-7]，采用高效液相色谱法对自制dbcAMP-Na的含量及有关物质分析方法进行了系统研究。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 二丁酰环磷腺苷钠供试品(力邦医药科技有限责任公司自制，5批：140707、140729、140814、140909、140915，制备方法见1.3)，二丁酰环磷腺苷钠(N6-2′-O-Dibutyryladenosine 3′，5′-cyclic monophosphate sodium salt)对照品(Sigma标准品，Lot#SLBG4203V)，杂质(N6-monobutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt)对照品(Sigma标准品，Lot#129K2101)，环磷腺苷(杭州美亚药业，国药准字H20083070)。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 LumTech高效液相色谱仪(配有Autosampler 5500进样器，K-2501UV Detecter，WATERS 2998 PDA，Clarity工作站)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌；DZF-6050真空干燥箱。

1.3 二丁酰环磷腺苷钠的制备 在装有环磷腺苷的烧瓶里缓慢滴加氢氧化钠水溶液(3 mol/L)，过程控温，滴加完毕升温至室温，用HCl溶液(20%)调节pH至7～8，加入无水乙醇析出白色固体，过滤、干燥得白色固体钠盐；将钠盐与正丁酐在N2保护下升温至140 ℃反应，TLC监控，反应完全后降至室温，缓慢加入甲基叔丁基醚，过程剧烈搅拌，得近白色固体粗品。甲基叔丁基醚与丙酮的混合溶液重悬得到白色粉末状目标产物。

1.4 二丁酰环磷腺苷钠的测定

1.4.1 对照品及供试品溶液：取dbcAMP-Na对照品及自制样品(批号：140915)各约25 mg，精密称定，分别置于100 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀作为储备液。精密量取各储备液5 mL置于50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，即配制成25 μg/mL的对照品及供试品溶液。

1.4.2 高浓度供试品溶液：用十万分之一的天平取自制dbcAMP-Na样品约25 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，作为供试品储备液。再精密量取高浓度储备液2 mL置于10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀即为浓度0.5 mg/mL的高浓度供试品溶液。

1.4.3 杂质对照品溶液：精密称定杂质对照品约25 mg，置于100 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，摇匀做为杂质对照品储备液。精密量取杂质对照品储备液1 mL至100 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，即配制成2.5 μg/mL的杂质对照品溶液。

1.4.4 色谱条件：色谱柱：Agilent 5 TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾与0.01 mol/L TBAB混合溶液(25:75)；流速1 mL/min；检测波长：273 nm；进样量：20 μL。

① 线性关系：精密称取dbcAMP-Na对照品25.65 mg置于100 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取8、8.8、9.6、10.0、10.4、11.2和12.0 mL分别置100 mL容量瓶中，加流动相稀释定容。分别取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积(n=3)。

② 仪器精密度：按照1.4.1项下方法配制得24.93 μg/mL的对照品溶液，按上述色谱条件进行分析，连续进样6次，分别以峰面积和保留时间考察仪器的进样精密度。

③ 溶液稳定性：按照1.4.1项下配制得24.47 μg/mL的对照品溶液和25.01 μg/mL的样品溶液，各取20 μL，分别于0、1、2、4、6、8、12和24 h时注入液相色谱仪，考察2者的溶液稳定性。

④ 重复性：精密称取dbcAMP-Na同一批次样品6份，每份约25 mg，按1.4.1项下方法配制成溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪，按外标法计峰面积(n=3)。

⑤ 回收率试验：配制浓度为0.983 mg/mL的对照品储备液待用，精密量取约15 mg的dbcAMP-Na样品9份，添加不同量的对照品储备液，分别配制成浓度为20，25，30 μg/mL的溶液各3份，进行加样回收率测定。

⑥ 含量测定：取一定量对照品及不同批次自制dbcAMP-Na样品，按本试验方法配制溶液，进样液相色谱分析，外标法计算出各批样品含量(n=3)。

1.5 相关物质测定

1.5.1 色谱条件同1.4.4项下。

1.5.2 线性关系：精密称取杂质对照品25.04 mg置于100 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；分别量取不同量的7份溶液置入容量瓶中，流动相稀释成浓度依次为0.050、0.100、1.00、2.00、2.50、3.00、3.75 μg/mL的杂质对照品溶液，取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积(n=3)。

1.5.2 重复性：精密称取dbcAMP-Na同一批次样品6份，每份约25 mg，按照1.4.3的方法配制成浓度为50 mg/mL的样品溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪，按外标法计峰面积(n=3)。

1.5.3 回收率试验：配制浓度为25 μg/mL的杂质对照品储备液待用，精密量取约25 mg的dbcAMP-Na样品(杂质含量按0.0211%计)9份，添加不同量的杂质对照品储备液，分别配制成杂质浓度为1.23，2.48，3.73 μg/mL的溶液各3份，进行加样回收率测定。

1.5.4 未知杂质测定：按照1.4.2项下的方法配制浓度为0.5 mg/mL的样品供试溶液，稀释200倍得浓度为2.5 μg/mL的自身对照溶液。取上述两种溶液各20 μL分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，各未知杂质峰面积总和小于对照溶液主成分峰的峰面积(0.5%)。采用自身对照法计算杂质含量。

2 结果

2.1 制备的二丁酰环磷腺苷钠 制备的二丁酰环磷腺苷钠为白色粉末状固体(收率>70%，HPLC>99%)已知降解杂质为酯水解产物，结构及HPLC图谱见图1、图2。

图1 二丁酰环磷腺苷钠及有关物质结构图Fig.1 Structure of dbcAMP-Na and its related substances

图2 二丁酰环磷腺苷钠HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of dbcAMP-Na

2.2 二丁酰环磷腺苷钠的测定结果

2.2.1 线性关系：3次测定的峰面积平均值对对照品溶液浓度进行线性回归，回归方程为：A=38.91C+2.840 r=0.9997，表明在20～30 μg/mL的范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.2.2 仪器精密度：精密度RSD峰面积为1.1%，RSD保留时间为0.4%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 溶液稳定性：对照品溶液的平均峰面积为955.121，RSD为1.5%；样品溶液的平均峰面积为961.630，RSD为1.7%。杂质含量与初始溶液浓度相比无明显变化，即对照品溶液和样品溶液至少在24 h内性质稳定。

2.2.4 重复性：样品平均含量为101.08%，RSD为0.4%(n=6)，表明该法重复性良好。

2.2.5 回收率试验：加样回收率高、中、低3个浓度加样回收率(n=3)依次为101.3%、101.1%、101.3%；总平均回收率为：101.2%，RSD为0.3%，表明dbcAMP-Na在以上3个浓度梯度范围内回收率良好。

2.2.6 含量测定：各批样品含量测定结果见表1。

表1 不同批次样品的含量测定结果Tab.1 Determination result of different batches sample

2.3 有关物质测定结果

2.3.1 最低检测线和定量限：当信噪比为3时，降解杂质的最低检测限为12.52 ng；当信噪比为10时，定量限为50.08 ng，该样品连续进样6针，计算平均保留时间为6.153 min，RSD值为0.11%，平均峰面积为2.364，RSD值为2.26%，说明在该定量限下，检测值稳定。

2.3.2 重复性：dbcAMP-Na同一批次样品的平均含量为0.0211%，RSD为4.53%(n=6)，表明该法重复性良好。

2.3.3 线性关系：3次测定的峰面积平均值对杂质对照品溶液浓度进行线性回归，回归方程为：A=43.53C+0.343，r=0.9999，表明在0.05～3.75 μg/mL的范围内杂质峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3.4 回收率试验：高、中、低3个浓度杂质加样回收率(n=3)依次为95.4%，92.2%，93.0%；总平均回收率为：93.5%， RSD为1.8%，表明该降解杂质在以上3个浓度梯度上回收率良好。

2.3.5 未知杂质测定：6份样品中各未知杂质平均含量均小于0.5%，杂质峰面积RSD均小于10%。

3 讨论

检测波长的选择取一定量的二丁酰环磷腺苷钠对照样品，配制成约50 μg/mL的溶液，用分光光度法在200～400 nm的波长范围内扫描，结果本品在272.3 nm的波长处有最大吸收，将检测波长定为273 nm；流动相的选择 采用乙腈-水(25:75)为流动相，考虑到样品钠盐易电离，极性大，在流动相中加入磷酸二氢钾缓冲盐，并加入少量表面活性剂增加其溶解性，能显著改善拖尾，得到较好的色谱图形。改变流动相流速分别为0.8、1.0、1.2 mL/min，柱温分别为30、35、40 ℃条件下以及采用2种不同的色谱柱(Agilent 5 TC-C18(2)；Ultimate XB-C18)进行检测，平均含量为99.16%，RSD为0.6%(n=3)。经验证，该检测方法重现性好，操作简便、快速、准确，可用于该药的质量控制。

本法专一性强，含量和有关物质测定的准确度和精密度均好，完全能够满足二丁酰环磷腺苷钠质量分析的要求，为控制二丁酰环磷腺苷钠的质量提供了可靠的定量方法依据。

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(编校：王冬梅)

Preparation of sodium dibutyryladenosine cyclophosphate and the determination of the content and related substances

HUO Ting,SUN Kai,WANG Lei,LI Zi-jian,GUO Sheng-qiang

(Xi’an Libang Pharmaceutical Co.LTD, Xi’an 710075, China)

ObjectiveTo prepare sodium dibutyryladenosine cyclophosphate(dbc AMP-Na)，and determine the content and related substances. MethodsDetermine the content and related substances of dbcAMP-Na by high performance liquid chromatography after prepared,The column：ODS C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；the mobile phase：acetonitrile-0.05mol/mL KaH2PO4solution(25:75)；the flow rate：1 mL/min；the content of dbcAMP-Na was detected at 273 nm. ResultsThe linear range of the determination of the content was 20～30 μg/mL，and the correlation coefficient was 0.9997；The precision was good(RSD=0.4%，n=6)；The recovery result was 101.2%(RSD=0.3%). The quantitative limit of relevant material is 50.08 ng/mL，which is stable under this concentration；The linear range of the determination was 0.05～3.75 μg/mL，r=0.9999；The precision was good(RSD=4.53%，n=6)；The recovery result was 93.5%(RSD=1.8%). ConclusionThe synthetic route of dbcAMP-Na is simple and with high product purity. The method to determine the content and related substances of dbcAMP-Na is easy to operate and the results of the determination are accurate。

sodium dibutyryladenosine cyclophosphate;prepare;content; HPLC;related substances

霍婷，女，硕士，工程师，研究方向：原料药及药物的合成制备与分析，E-mail：huoting-714@163.com。

R927

A

1005-1678(2015)02-0171-03