HPGPC法测定麦芽糖铁糖浆分子量与分子量分布

焦旭雯，梁蔚阳

(广东省食品药品检验所 生检生化室，广东 广州 510180)



HPGPC法测定麦芽糖铁糖浆分子量与分子量分布

焦旭雯，梁蔚阳Δ

(广东省食品药品检验所 生检生化室，广东 广州 510180)

目的 建立测定麦芽糖铁糖浆的分子量与分子量分布的方法。方法 采用高效凝胶色谱法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)，色谱柱为PSS HEMA凝胶色谱柱，检测器为示差折光检测器，流动相为磷酸盐缓冲液(pH6.8)，柱温为45 ℃，流速为0.5 mL/min。结果 3批样品的重均分子量分布在45000～47000 Da之间，精密度、重现性好。结论 该方法简单，重现性好，可以作为控制麦芽糖铁糖浆中分子量与分子量分布的方法。

高效凝胶色谱法；麦芽糖铁糖浆；分子量；分子量分布

麦芽糖铁是一种新型的多糖铁复合物，用麦芽糊精将铁离子稳定地络合在其中，控制铁的释放，铁离子能与铁转运蛋白和铁蛋白结合以发挥作用，并防止释放大量的游离铁，减少有毒氧化物的形成[1]。麦芽糖铁糖浆由麦芽糖铁、蔗糖、山梨醇、奶油香精及适量防腐剂组成，它能有效地提高轻到中度缺铁性贫血患者的Hb和血清铁蛋白浓度，其作为补铁剂不仅有合适的络合稳定性，对胃肠道无或甚少刺激性，而且当其释放铁之后，本身具有多方面的生物活性，属于对机体有益的成分，可被吸收利用[2]。多糖是天然高分子中具有多分散性的聚合物，平均分子量及其分布宽度不仅是决定多糖理化性质及活性的基本参数之一，而且与其临床疗效及过敏反应的发生关系密切，是评价药效、控制生产和改进产品质量的主要根据和重要指标，因此研究多糖就必须掌握其分子量与分子量分布的测定方法[3]。本文利用高效凝胶色谱法测定了麦芽糖铁分子量及分子量分布，为麦芽糖铁糖浆生产的质量控制提供方法和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：WATERS 2690型高效液相色谱仪，410示差折光检测器，柱温控制系统，自动进样系统， GPC数据分析软件(美国Waters公司)；Sartorius BP211D电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；Millipore公司超纯水系统。

1.1.2 药品与试剂：3批麦芽糖铁糖浆(瑞士Vifor制药公司，批号：320111、426001、427001)；

葡聚糖分子量标准对照品(Shodex standard p-82 lot No：130901)；其余试剂均为分析纯；配制溶液所用水均为Millipore公司超纯水系统制得。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：PSS HEMA Bio analytical，8 mm×300 mm，孔径分别为1000 Å与100 Å的色谱柱2根串连；示差折光检测器检测池温度：45 ℃；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.8)(取磷酸氢二钠35.8 g、磷酸二氢钠13.8 g与叠氮化钠1.0 g，加水溶解并稀释至5000 mL，用磷酸调节pH值至6.8)；柱温：45 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：25 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备：分别取葡聚糖对照品p5、p10、p20、p50、p100、p200，用流动相溶解并稀释制成每1 mL中各约含10 mg的溶液，于25 ℃静置2～3 h，作为对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备：取麦芽糖铁糖浆适量(按Fe计算，10 mg/ml)，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.4 葡聚糖标准曲线的绘制：分别精密量取上述葡聚糖系列对照品溶液注入液相色谱仪，记录洗脱峰的保留时间，采用GPC软件绘制标准曲线。

1.2.5 重现性考察：取样品(批号：427001)，依1.2.3项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，按1.2.1项下色谱条件测定其分子量与分子量分布。

1.2.6 样品测定：分别取3批麦芽糖铁糖浆，依1.2.3项下方法制备供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件测定样品分子量与分子量分布。

2 结果

2.1 葡聚糖标准曲线的绘制 以对照品标准分子量的对数值为纵坐标、相应色谱峰的保留时间为横坐标进行3阶线性拟合。见图10得到回归方程lg M=-0.0005T3+0.0321T2-0.8921T+14.791，r=0.9999。见表1，校正曲线图见图2。

表1 葡聚糖系列对照品标准分子量及保留时间

图1 葡聚糖系列对照品色谱图Fig.1 A series of reference samples of the dextran

图2 GPC校正曲线图Fig.2 GPC calibration curve

2.2 重现性试验 重均分子量(Mw)分别为45911、46772、46893、47056、46933、47678Da，RSD为1.21%；数均分子量(Mn)分别为31346、31780、31908、31948、31811、32489Da，RSD为1.15%。试验结果表明建立的方法重复性良好。

2.3 样品测定 样品分子量与分子量分布测定结果见表2，色谱图见图3。同时按处方分别配制各辅料溶液，按1.2.1项下色谱条件进样，得到各辅料峰的重叠图谱，见图4。

表2 3批样品分子量与分子量分布测定结果

图3 样品色谱图(PSS HEMA Bio analytical 1 000Å、100Å串联色谱柱，批号：427001)1：麦芽糖铁；2：山梨醇；3：奶油香精；4：防腐剂Fig.3 Sample chromatogram(PSS HEMA Bio analytical 1 000Å、100Å Series column No：427001)1: Iron Maltose Syrup; 2: sorbitol; 3:cream flavor;4:preservatives

图4 辅料重叠图谱(PSS HEMA Bio analytical 1 000Å、100Å串联色谱柱，批号：427001)1：山梨醇；2：奶油香精；3：防腐剂Fig.4 Supplementary material chromatogram(PSS HEMA Bio analytical 1 000Å、100Å Series column No：427001)1: sorbitol; 2:cream flavor;3:preservatives

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 TSK-GEL PW系列色谱柱适用于以凝胶色谱的模式分析分离蛋白质、多肽、多糖、寡糖、DNA、RNA、水溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子样品等[4]。本研究曾尝试选用TSK G4000PWXL凝胶色谱柱(排阻范围：2×103～3×105)进行分析，但结果表明(见图5)，样品基线分离效果较差，无法测得样品10%小分子部分重均分子量。经比对，PSS HEMA Bio analytical系列色谱柱主要适用于中性和阴离子聚合物，如蛋白质、酶、多糖(羧基修饰的多糖)、水溶性淀粉等。采用孔径为1 000Å的色谱柱(排阻范围：103～5×105)进行分析(见图6)，样品基线分离效果有所改善，同时分子量分布宽度变窄，但仍无法测得样品10%小分子部分重均分子量。经比较上述结果(表3)，测得样品重均分子量约为40 000～50 000，采用PSS HEMA Bio analytical，8 mm×300 mm，100Å色谱柱(排阻范围：100～6×104)进行分析，由于样品10%大分子部分重均分子量超过排阻限，该规格色谱柱所分离的麦芽糖铁色谱峰峰形相对较差，但可以分离出更多的辅料峰(见图7)。综上所述，考虑将PSS HEMA Bio analytical 1 000 Å和100 Å两根色谱柱串联，一方面可以得到峰形较好的麦芽糖铁色谱峰，另一方面得到更多的辅料峰。如图4所示，经过尺寸排阻与配位交换，麦芽糖铁的出峰时间相应延长，山梨醇、奶油香精、防腐剂等辅料被有效分离，各组分峰基本达到基线分离[5]，为获得准确可靠的结果打下基础。

表3 不同色谱柱测定结果比对

图6 样品色谱图(PSS HEMA Bio analytical 1 000Å色谱柱，批号：427001)Fig.6 Sample chromatogram(PSS HEMA Bio analytical 1 000Å column，No：427001)

图7 样品色谱图(PSS HEMA Bio analytical 100Å色谱柱，批号：427001)Fig.7 Sample chromatogram(PSS HEMA Bio analytical 100Å column，No：427001)

3.2 流动相的选择 在高效凝胶色谱法中，一般使用以水为主体，具有不同pH值的多种缓冲溶液作为流动相，一般条件为pH6～8。当样品分子带负电荷，流动相中缓冲液浓度低时，发生静电排斥，样品组分靠近排阻位置被洗脱出，降低pH值既可减少样品分子与色谱柱上的负电荷，也能降低静电排斥[6]。同时，增大流动相离子强度可以中和电离的硅羟基与带相同电荷的样品分子之间的静电排斥作用。因此本文采用磷酸盐缓冲液(pH6.8)作为流动相，将有利于样品洗脱，保持良好的分子量线性关系和优异的色谱峰形。

3.3 样品浓度 由于高分子量的样品溶液黏度较大，HPGPC的载样容量与交互作用色谱相当。样品的黏度较大会因为待测分子的局部浓度过高而导致峰形扭曲和变宽，此外载样量过大也会导致这种结果[7]。本文取样品直接滤过进样，分别考察进样量为5、10、25、50、100 μL，经比对，当进样量大于25 μL时，麦芽糖铁峰的保留时间略为延迟，显示色谱峰有变宽的倾向。因此本法设定进样量为25 μL，在8 mm×300 mm柱中使样品进样量仅为0.25 mg，可以较真实的测定出样品分子量与分子量分布。

3.4 其他 由于葡聚糖系列标准品与样品的结构差异、凝胶柱对其可能产生的吸附作用、分子在柱上扩散，以及葡聚糖的浓度、黏度、测定温度的微小差异均可能影响分子量的精确性[8-11]。本文采用高效凝胶色谱法测定麦芽糖铁糖浆中分子量及分子量分布，通过一系列的验证试验，证明该法操作简便，重现性好，准确可行，为科学制订麦芽糖铁糖浆的质量标准提供依据。

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(编校：谭玲)

Determination of molecular weight and weight distribution in Iron Maltose Syrup by HPGPC

JIAO Xu-wen, LIANG Wei-yangΔ

(Health Inspection Biochemical Laboratory，Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China)

ObjectiveTo establish a method for determining the molecular weight (Mw) and molecular weight distribution of Iron Maltose Syrup.MethodsHPGPC was used; PSS HEMA was used as column.Detector was differential refraction detector.Mobile phase was phosphate buffer solution (pH6.8) at 0.5 mL/min, column temperature was 45 ℃.ResultsThe Mw of 3 batches of Iron Maltose Syrup were 45000-47000 Da with good linearity, precision and reproducibility.ConclusionThe method is simple, reliable and accepted by the specification for controlling the molecular weight and weight distribution of Iron Maltose Syrup.

HPGPC; Iron Maltose Syrup; molecular weight; molecular weight distribution

广东省科技计划项目(2013B0402000029)

焦旭雯，女，硕士，主管药师，研究方向：生化药品检验，E-mail：jjxxww17@163.com；梁蔚阳，通信作者，女，硕士，主任药师，研究方向：生化药品及生物制品质量控制工作；E-mail：wl-1023@163.com。

R917

A

1005-1678(2015)10-0131-03