张秀霞,张守娟,张 涵,韩雨彤,郭云霞
(中国石油大学 环境与安全工程系,山东 青岛266580)
固定化微生物对石油污染土壤生物学特性的影响
张秀霞,张守娟,张 涵,韩雨彤,郭云霞
(中国石油大学 环境与安全工程系,山东 青岛266580)
在固定化微生物对石油污染土壤修复35 d的过程中,考察了土壤脱氢酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、脲酶活性及细菌数量几种生物学特性的变化规律,进一步分析其石油烃降解率变化与酶活性、细菌数量之间的相关性,并以添加游离菌、秸秆及土著菌的土壤对照。结果表明,固定化微生物修复石油污染土壤的各个阶段,细菌数量、酶活性均高于对照组,石油烃降解效果最好,降解率高达40.8%;土壤的脲酶活性与其石油烃降解率的相关性最显著,相关性系数为0.994,可以作为固定化微生物降解石油污染土壤效果的指标。
固定化微生物;生物学特性;相关性;降解率
随着石油化工工业的发展,在勘探、开采、运输及储存过程中,油田周围大面积的土壤受到石油的污染,石油混合物已经成为土壤中主要污染物[1]。石油污染导致土壤的通透性降低,土壤的营养结构失调,严重影响土壤的肥力[2],还严重影响土壤的酶活性,使土壤微生物数量降低,导致新陈代谢缓慢[3]。所以石油污染土壤的治理是国内外研究的热点。
近年来很多学者研究表明,高等植物、指示微生物、蚯蚓、土壤酶等可以用来评价和监测污染土壤修复过程[4-6]。其中,土壤酶是一种生物催化剂,可有效地促进土壤中的有机污染物降解[7-8],成为石油污染土壤生态系统的中心。
笔者从土壤生物学特性角度出发,考察固定化微生物在修复过程中土壤脱氢酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、脲酶活性和细菌数量与石油烃降解率的变化规律,然后使用SPSS18.0软件对石油烃降解率变化与生物学特性进行相关性分析,揭示固定化微生物高效降解石油烃的原因,为实际应用提供理论指导。
1.1 实验材料
石油污染土样取自新疆风城油田作业区附近被石油污染的土壤,风干,碾碎,装瓶置于4℃冰箱备用。菌种来自大庆油田、新疆风城作业区等15个石油污染土壤,经过层层筛选驯化培养,选取石油烃降解率最高的菌株作为后续固定化对象,培养基中原油降解率为51.7%。
1.2 实验方法
1.2.1 土壤理化性质
采用超声萃取-紫外分光光度法[9]测定得到供试土样石油烃质量分数平均为4.72%;采用重量法测得供试土样含水率在8.58%~8.86%范围;采用pH S-3酸度计电位法测得土样的pH值为7.2;采用重铬酸钾容量法测得土样的有机质质量分数在47.12~51.84 g/kg范围;采用半微量凯氏法测定土壤的全氮质量分数为0.145~0.161g/kg;采用钼锑抗比色法测定土壤的速效磷质量分数为2.911~3.231×10-3g/kg[10]。
调节土壤的有机质含量与全氮、速效磷的质量比m(C)∶m(N)∶m(P)=100∶10∶1。土壤的含水率保持在18%左右。
1.2.2 土壤生物学特性测定
采用比色法(波长为485 nm)测定土壤脱氢酶活性,每1 g干土6 h生成的TPF为脱氢酶的一个活性单位;采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性,单位为0.1 KMnO4/(h·g);采用比色法(波长为578 nm)测定脲酶活性,以24 h后1 g土壤中含NH3-N的mg数表示;采用比色法(波长为430 nm)测定多酚氧化酶活性,以2 h后每1 g土的紫色没食子酸的mg数表示[11],采用稀释平板计数法测定土壤的细菌量。测得的土壤脱氢酶、过氧化氢酶活性及细菌数量分别为0.0049 mg/(g·6h)、0.16 mL(0.1 KMnO4)/(h·g)、7.56×107个/g,脲酶、多酚氧化酶活性均未检出。
1.2.3 固定化微生物制备及生物量测定
以实验室前期筛选出来吸菌量较大、降油率较高的秸秆DG作为载体,将其粉碎后筛分至40目,采用吸附法制备固定化微生物。采用稀释平板计数法测定生物量[12],计算1 mL游离菌菌液与1 g固定化微生物的细菌数量之间的关系,得到1 g固定化微生物相当于8.58 mL游离菌菌液。使用牛肉膏蛋白胨为细菌培养基[13]。
1.2.4 微生物修复石油污染土壤花盆模拟实验
4个花盆中各盛500 g供试土样,然后在其中3个花盆分别添加按100 g土样加10 mL比例的活化的游离菌菌液、同等生物量的固定化微生物、5.83 g灭菌秸秆,最后1个花盆不添加任何微生物。将这4个花盆置于30℃恒温培养箱中进行35 d室内土壤修复实验。每1 d翻耕浇水,以保证微生物充足的氧气和水分,每隔7 d分别测定它们的脱氢酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、脲酶活性,细菌数量及石油烃质量分数。采样前,将土壤翻耕均匀,以四分法分样,取3个平行样,以平均值计为结果,并研究石油烃降解率与酶活性的相关性。
2.1 微生物修复石油污染土壤时石油烃降解率的变化
秸秆、游离菌、固定化微生物、土著菌35 d修复石油污染土壤过程中石油烃降解率的变化如图1所示。由图1可见,固定化微生物修复35 d,石油烃降解率达到40.8%,高于秸秆、游离菌、土著菌3个对照组,它们的石油烃降解率分别为18.6%、21.7%、6.9%。固定化微生物和游离菌在修复的前14 d石油烃降解率增加缓慢,14~28 d时效果明显增加,游离菌修复的土壤降解率一直比较低,而且降解缓慢,35 d时二者均达到最高值。秸秆对石油烃的降解有一定的效果,因为秸秆能为土著菌提供一定的营养物质,提高土壤中酶活性,进而降解石油烃。由于石油烃的挥发及土著菌的降解,只含土著菌的石油污染土壤也有一定的降解率。
图1 不同微生物修复石油污染土壤的石油烃降解率随时间的变化
2.2 固定化微生物对土壤生物特性影响
2.2.1 对脱氢酶活性的影响
微生物对石油烃的降解或转化从脱氢开始,起着氢的中间转化传递作用,因此可以利用脱氢酶活性作为评价微生物降解石油烃能力的指标。微生物对石油污染土壤35 d修复过程中脱氢酶活性的变化如图2所示。由图2可见,无论固定化微生物、游离菌还是秸秆都能使土壤脱氢酶活性逐渐增强,其中固定化微生物修复土壤的脱氢酶活性增加幅度最大,从0.0049 mg/(g·6h)增至0.1840 mg/(g·6h),游离菌略小,增至0.1570 mg/(g·6h)。王旭辉等[14]研究表明,脱氢酶活性与石油烃降解率变化趋势基本相同。固定化微生物的石油烃降解率一直处在较高的水平(见图1),在修复初期,由于微生物不适应新环境,不能分泌大量的土壤酶,导致脱氢酶活性变化不明显;修复7~21d,脱氢酶活性增加迅速,说明土壤微生物新陈代谢增强,脱氢酶大量分泌;21 d后各种修复方式的脱氢酶活性增加缓慢,可能是由于降解石油烃过程中产生了难降解物质积累以及有毒代谢产物增加,抑制酶活性增强。秸秆处理的土壤的脱氢酶活性也增加,添加秸秆能够改善土壤理化性质,提高土壤肥力[15],刺激脱氢酶的分泌。
2.2.2 对过氧化氢酶活性的影响
过氧化氢酶能促进H2O2分解生成O2和H2O,防止H2O2对生物体的毒害[16]。石油污染土壤35 d修复过程中过氧化氢酶活性变化如图3所示。由图3可见,在修复过程中,过氧化氢酶活性均呈现先增大后减小的趋势。添加游离菌、秸秆及固定化微生物都能够增加土壤微生物密度,微生物的呼吸作用增加微生物对土壤中H2O2的分解,促进了过氧化氢酶的分泌,导致酶活性增大。其中,固定化微生物和游离菌修复初期,过氧化氢酶的活性相近,分别为0.153 mL(0.1KMnO4)/(h·g)和0.150 mL(0.1KMnO4)/(h·g);修复14 d后,固定化微生物修复的土壤中过氧化氢酶活性明显增加;土壤修复21d后,过氧化氢酶活性稍有降低后几乎不再变化,是由于石油烃分解后产生有毒物质积累抑制了酶活性的分泌[17]。由于过氧化氢酶活性与微生物呼吸量显著相关[18],游离菌和秸秆修复28 d后,土壤中微生物数量少,呼吸作用弱,过氧化氢酶活性小幅度减小。固定化微生物、游离菌、秸秆、土著菌修复土壤35 d,过氧化氢酶活性分别为0.60、0.53、0.49、0.26 mL(0.1KMnO4)/(h·g)。固定化微生物修复的土壤过氧化氢酶活性显著增加,为高效降解石油烃提供依据。
图2 微生物修复石油污染土壤过程中脱氢酶活性的变化
图3 微生物修复石油污染土壤过程中过氧化氢酶活性的变化
2.2.3 对多酚氧化酶活性的影响
多酚氧化酶能将土壤芳香族化合物氧化成醌,醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成大小分子质量不等有机质和色素,完成土壤芳香族化合物循环,促进土壤有机碳的累积,改善土壤物理性状[19]。土壤中多酚氧化酶是一类具有重要功能的酶,与土壤酚类物质的含量呈正比,在污染土壤石油烃的降解过程中不断产生酚类物质来促进微生物形成多酚氧化酶,提高了多酚氧化酶活性。
石油污染土壤35 d修复过程中多酚氧化酶活性变化如图4所示。由图4可见,4种微生物修复石油污染土壤过程中多酚氧化酶酶活性有不同程度的增大。前期的实验证明,土壤有机质、全氮、速效磷含量在修复过程中逐渐降低,与刘清秀等[20]研究多酚氧化酶活性与土壤的有机质、全氮、速效磷呈负相关的结果一致。固定化微生物35 d修复石油污染土壤过程中,多酚氧化酶活性变幅最大,从起初未检出增至10.01 mg/(g·2h);秸秆修复过程中多酚氧化酶活性增至8.55 mg/(g·2h);而游离菌和土著菌修复时,多酚氧化酶分别提高到5.52 mg/(g·2h)和0.71 mg/(g·2h)。相比而言,固定化微生物和秸秆在土壤修复过程中对多酚氧化酶活性的增强效果最好,这是由于秸秆的加入有利于土壤微生物对多酚氧化酶的分泌[15]。
图4 微生物修复石油污染土壤过程中多酚氧化酶活性的变化
2.2.4 对脲酶活性的影响
脲酶是一种酰胺酶,可促进有机物质中碳氮键(CO—NH)的水解,对土壤氮素循环发挥着重要作用;其活性的提高有利于土壤中稳定性较高的有机氮向有效氮的转化,从而改善氮素供应状况,在石油污染土壤生物修复中可反映土壤氮素转化状况及营养水平[21]。
石油污染土壤35 d修复过程中脲酶活性的变化如图5所示。由图5可见,土壤中脲酶活性随修复时间的延长而增加,固定化微生物修复土壤的脲酶活性始终高于对照组,游离菌的略高于秸秆的。在石油污染土壤修复35 d内,固定化微生物修复土壤的脲酶活性从起初的0增至0.29 mg/(g·h)。土壤修复初期脲酶活性变化缓慢,7 d后快速升高,表明土壤中添加的微生物大量繁殖,促进土壤氮素的转化活跃,促进了脲酶的分泌;21 d后营养物质大量消耗,易降解组分的减少,多环芳烃(PAHs)含量的相对增加,导致脲酶活性变化缓慢。邱莉萍等[22]提出,脲酶活性与土壤肥力有显著相关性,秸秆的加入改善了土壤的营养结构,所以秸秆修复的土壤脲酶活性也有所增加。
图5 微生物修复石油污染土壤过程中脲酶活性的变化
2.2.5 土壤细菌量的变化
石油污染土壤35 d修复过程中细菌量的变化如图6所示。由图6可见,在几种修复方式修复过程中,细菌数量呈先增大后变化平缓或降低的趋势,但数量上升的幅度不同;固定化微生物修复的土壤细菌数量增大最多,从1.29×108增至1.62×1011,其次是游离菌修复,细菌数量增至3.98×1010,表明固定化微生物和游离菌的加入提高了土壤细菌量,为石油烃的降解提供了动力。在修复初期,降解菌不适应土壤环境,细菌量变化不大,随着修复时间的延长,细菌以石油烃为碳源,不断繁殖,细菌量迅速增多。这一现象在固定化微生物修复土壤的过程中较为明显,一方面是因为,固定化秸秆材料利用其多孔特性将细菌吸附在内孔里,提高了微生物密度[23],减少外界干扰;另一方面是因为,秸秆能够分散油类,将油类吸附在秸秆表面上[24],提供给秸秆上的石油降解菌养分,细菌数量增多,石油烃降解率随之提高。在修复末期细菌数量变化不大或者降低,是因为在降解石油烃的过程中产生的中间产物对细胞有毒害作用。
图6 微生物修复石油污染土壤过程中细菌量的变化
2.3 土壤生物学特性与石油烃降解率的相关性
通过SPSS18.0分析了固定化微生物、游离菌对污染土壤石油烃降解率与土壤生物学特性的相关性,结果列于表1。由表1可见,土壤生物学特性,即脲酶、脱氢酶、多酚氧化酶、细菌量、过氧化氢酶活性与固定化微生物、游离菌修复时的石油烃降解率相关性依次降低;脲酶活性与固定化微生物、游离菌的石油降解率的相关性最高,相关系数分别为0.994、0.981,所以脲酶活性可以作为石油烃生物降解情况的重要指标,与Li等[25]的研究结果一致。细菌量与石油烃降解率的相关性并不高,可能由于细菌量在一定程度上并非准确反映土壤微生物活性[26],酶活性能够直观反映石油烃降解菌的活性,所以其作为土壤石油烃降解率的指标更具有说服力。
表1 固定化微生物和游离菌的石油烃降解率与土壤生物学特性的相关性
1) Correlation is significant at the 0.01 level (1-tailed); 2) Correlation is significant at the 0.05 level (1-tailed)
(1)固定化微生物修复石油污染土壤35 d的过程中,土壤中细菌数量增幅最大,且各种酶的分泌能力强于其他修复方式,石油烃降解率最高达到40.8%,高出游离菌的约20%。
(2)固定化微生物对土壤中的各种生物酶的分泌有较强的促进作用,修复35 d后脱氢酶活性从0.0049增至0.184 mg/(g·6h),过氧化氢酶活性从0.15增至0.60 mL(0.1KMnO4)/(h·g),多酚氧化酶活性从0增至10.01 mg/(g·2h),脲酶活性从0增至0.29 mg/(g·h),从而加强了对石油烃的降解。
(3)石油污染土壤石油烃降解率与其生物学特性具有显著相关性。固定化微生物、游离菌修复石油污染土壤的石油烃降解率与脲酶活性存在极显著相关性,相关性系数分别达到0.994、0.981,与细菌量的相关系数分别达到0.901、0.893。土壤中的脲酶活性更能准确反映土壤中石油烃的降解状况。
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Influence of Immobilized Microorganism on Biological Characteristics of Petroleum-Contaminated Soil
ZHANG Xiuxia, ZHANG Shoujuan, ZHANG Han, HAN Yutong, GUO Yunxia
(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)
In the process of 35 d remediation of petroleum-contaminated soil by immobilized microorganism, the changes of dehydrogenase, catalase, polyphenol oxidase, urease activity and bacteria number in the soil were investigated with the free bacteria, straw, native bacteria as the control group. Further, the correlations of hydrocarbon degradation rate with soil enzyme activities and bacteria number were analyzed. The results showed that at each stage of petroleum-contaminated soil remediation by immobilized microorganism, soil bacteria number and enzymatic activity were higher than that by the control group, so the hydrocarbon degradation rate could reach 40.8%. The correlation between hydrocarbon degradation rate and urease activity was significant, with the correlation coefficient of 0.994, thus urease activity could be the indicator for hydrocarbon degradation efficiency in petroleum-contaminated soil remediation by immobilized microorganism.
immobilized microorganism; biological characteristics; correlation; degradation rate
2013-10-28
山东省自然科学基金(ZR2014BM023)、中国石油科技创新基金(2009D-5006-07-01)、青岛市科技发展指导计划项目(KJZD-12-65-jch)、中央直属高校科研专项基金(11CX05011A)、中国石油大学(华东)研究生创新工程项目(CX-1219和CX2013035)资助
张秀霞,女,教授,博士,从事石油污染土壤修复研究;E-mail zhxiuxia@upc.edu.cn
1001-8719(2015)01-0112-07
X53
A
10.3969/j.issn.1001-8719.2015.01.018