锌胁迫对狗牙根生理特性及锌积累的影响——以三峡库区消落带适生植物狗牙根为例

董凯馨 张 帅 吴洁宁 余顺慧

（重庆三峡学院，三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆万州 404100）

锌胁迫对狗牙根生理特性及锌积累的影响
——以三峡库区消落带适生植物狗牙根为例

董凯馨 张 帅 吴洁宁 余顺慧

（重庆三峡学院，三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆万州 404100）

为了阐明锌胁迫对三峡库区消落带适生植物狗牙根(Cynodon dactylon(Linn.)Pers)的毒害机制，为锌污染水体、土壤植物修复提供理论依据．研究重金属锌对草本植物狗牙根新芽数、新根数、叶绿素、抗氧化酶系统的变化及重金属锌累积与分布的影响．结果表明：在0～80 mg/L Zn2+处理范围内，低浓度Zn2+对狗牙根新芽数、新根数及叶绿素含量表现出一定的促进性，新芽和新根数增加，叶片叶绿素含量提高；高浓度Zn2+导致狗牙根新芽和新根数、叶片叶绿素含量下降．当营养液中外源锌浓度＜ 40 mg/L时，狗牙根叶片中SOD、POD酶活性都增加，但当Zn2+浓度＞ 40 mg/L时,狗牙根叶片中SOD和POD酶活性降低，而CAT活性一直下降．狗牙根积累的锌主要分布于地下部分根，其次为茎．狗牙根能明显吸收江水中的Zn2+，故狗牙根可以用于修复被锌污染的水体、土壤，狗牙根具有潜在的应用价值．

锌胁迫；狗牙根;生理特性；积累

锌是植物微量营养元素，同时也是环境污染元素．而三峡库区消落带重金属的来源在于库区废弃物处置、大量施用农药和化肥以及冶炼、采矿、加工等，这导致了重金属污染土壤、水体等环境，主要通过食物链的途径对人类的健康造成威胁．故消除三峡库区消落带（土壤、水体中的）重金属污染，是目前急需解决的问题之一．因此，研究锌污染水体、土壤修复新技术具有重要意义．利用超积累植物对重金属的富集特性而进行植物修复，具有廉价、高效和安全等特点，已经成为土壤、水体中重金属污染研究领域的一项新兴技术[1]．但多数超积累植物是入侵植物，存在生态安全隐患．狗牙根为多年生禾本科单子叶植物，其再生能力强，长期研究发现，其既耐干旱又耐深水淹没，该物种对湿地（如三峡库区消落带）的生物修复与重建具有显著的效果[2-4]．近年来，虽然国内外许多学者致力于研究在重金属胁迫下植物的耐性机理，如：本实验室用重金属铜、铅等胁迫狗牙根以研究其耐性机理，并取得了一定的成绩[5-8]．但锌胁迫狗牙根的耐性机理鲜有报道．本研究采用水培的方法，以狗牙根为研究材料[7]，通过研究锌胁迫下狗牙根叶片中各项生理指标，如：叶绿素含量、SOD、POD、CAT活性等的变化，弄清其耐性机理，以筛选耐重金属的植物，为修复被重金属污染的消落带环境（土壤、水体）提供理论依据．

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验植物 狗牙根(Cynodon dactylon）采于三峡库区万州牌楼消落带．

1.1.2 试剂 Zn(NO3)2·6H2O（分析纯）；用分析纯配制霍格兰德营养液．

1.1.3 实验仪器及设备 AA-6300原子吸收分光光度计（日本岛津公司）、紫外分光光度计（T6新世纪）、MARS240微波消解系统（美国CEM公司）、TDZ5-WS多管架自动平衡离心机．

1.2 实验设计方案

设5组实验，锌浓度分别为0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，80 mg/L，以模拟Zn2+污染环境．每组3个平行．

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理 将采回的狗牙根幼苗依次经过土培至长出新叶．移出，用自来水、去离子水冲洗整个植株，待去离子水中检测不出Zn2+为止，最后放人广口试剂瓶（65 mL）中，采用霍格兰德营养液进行纯化培养．当长出新根后，在不同锌浓度的营养液中进行实验（将植株移入）．24 h连续通气，将植株放在窗前，以进行光合作用，每天观察．补充液体量的蒸发量，过5 d更换一次营养液．所有营养液中的KH2PO4浓度减少为0.005 mmol/L（为了防止沉淀生成）．

1.3.2 检测生理指标 实验期间每天观察植物的生长状况，发现处理29 d后开始出现中毒症状，停止实验，收获植株以检测其生理指标[5]．各项指标及测定方法是：“南京建成生物工程研究所”所购买的试剂盒用于测定SOD、POD活性．用分光光度法[9]测定CAT活性，用丙酮—乙醇分光光度法[10]测定叶绿素含量．

1.3.3 锌含量的测定 将被锌胁迫29 d后的植株先用去离子水洗净，茎和根分离，烘干（80oC鼓风干燥箱），剪碎、研磨成均匀粉末[6]，0.200 0 g粉末被称取，置于微波消解罐中，并加入混酸（浓HNO3︰浓H2SO4=4︰1）进行消解，冷却，过滤，滤液在25 mL容量瓶中定容，在塑料瓶中保存，测定粉末中Zn2+含量用原子吸收分光光度计（单位为mg/kg干重）．

1.4 分析数据

对数据进行分析并作图采用Sigmapiot10.0软件．

2 结果与讨论

2.1 在外源锌胁迫下狗牙根生长的影响

外源Zn2+胁迫时， 随Zn2+浓度的逐渐升高对狗牙根的生长影响明显（如图1）：Zn2+浓度小于40 mg/L 时，狗牙根的新发芽数和新产生的根数均高于对照组，有逐渐增加的趋势，在锌浓度为40 mg/L时达到最大值；Zn2+浓度达到80 mg/L 时生长缓慢，29 d后出现明显的毒害症状，第30 d 死亡． 说明低浓度的Zn2+促进狗牙根生长，而较高浓度抑制其生长．

图1 锌胁迫对狗牙根植株新芽数、新根数的影响Fig.1Effects of Zn2+stress on the new sprout number，the new root number of C. dactylon

2.2 Zn2+胁迫对狗牙根抗氧化酶系统的影响

2.2.1 Zn2+胁迫对狗牙根SOD活性的影响

在植物体内存在一个抗氧化酶系统，由SOD、POD、CAT三者组成，若要有效清除植物细胞内的自由基和过氧化物[6,7]，则需要它们三者的相互协调作用．

SOD酶的功能是清除细胞内的活性氧自由基，在重金属胁迫的逆境条件下，SOD能及时有效的清除狗牙根细胞内产生的大量活性氧自由基，最终保护了植物不被重金属胁迫[6-7]．图2可知，在低浓度重金属Zn2+胁迫时，SOD酶活性升高，由于活性氧自由基的产生．Zn2+浓度为40 mg/L时，SOD活性达到最大；但随处理浓度的进一步升高，导致自由基在植物叶片细胞内的大量积累，从而造成对植物细胞的过氧化伤害．因为重金属Zn2+在狗牙根体内积累量加大使狗牙根叶片细胞内保护酶系统清除活性氧自由基能力减弱，故高浓度Zn2+处理使狗牙根SOD活性下降．这与周长芳、吴国荣等的研究结果一致[8]．

2.2.2 Zn2+胁迫对狗牙根POD活性的影响

在植物抗氧化系统中，POD酶和SOD酶一样重要．其功能是将歧化产物（SOD酶的）分解成水和双氧水．经研究发现严重的逆境也可能增强POD的活性，由于逆境诱使植物产生更多的过氧化物．植物组织受到损害和破坏的程度越高，其POD活性也高[7]．由图2可知，Zn2+处理浓度在0~20 mg/L时狗牙根叶片的POD活性稳定呈略微上升趋势；20~40 mg/L时上升幅度比较大，在重金属Zn2+胁迫作用下，随Zn2+浓度的升高，植株叶片内POD活性也增加，此时Zn2+胁迫诱导了植物细胞内POD活性[6]．Zn2+浓度大于40 mg/L时POD活性呈缓慢下降趋势，这可能是因为随着Zn2+处理浓度的进一步增大，狗牙根细胞内氧自由基含量的增加导致膜脂过氧化加剧，有害物质大量产生，使POD活性下降，失去对细胞的保护作用．这与王爱云等的研究结果一致[11]

2.2.3 Zn2+胁迫对狗牙根CAT活性的影响

CAT是H2O2分解为O2和H2O的生物催化剂，能够清除植物体内的H2O2[7]．从图2可知，随着Zn2+浓度的增加，CAT活性呈下降趋势，这可能是因为随着Zn2+浓度的增加和作用时间的延长，狗牙根体细胞内SOD活性增加，导致H2O2生成量增多，过量的H2O2导致过氧化损伤，使狗牙根受到伤害，使CAT内在分子结构发生改变．因此，Zn2+胁迫抑制CAT酶的活性，表现出狗牙根叶片细胞中CAT酶的活性下降，这说明CAT活性更容易受到伤害[6]．

图2 锌胁迫对狗牙根植株CAT、SOD和POD酶活性的影响Fig.2Affects of Zn2+duress on the activities of CAT 、SOD and POD in leaves of C. dactylon

2.3 Zn2+胁迫对狗牙根叶绿素含量的影响

由图3可见，狗牙根经Zn2+处理后，在Zn2+浓度小于40 mg/L时，狗牙根叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量逐渐上升，这时叶绿素在Zn2+胁迫初期表现出一定的抗逆性．继而随着Zn2+浓度继续增大，叶绿素含量迅速减少，整体趋势呈下降．可能是由于Zn2+大量进入狗牙根叶片细胞内，加速叶绿素分解，同时导致叶绿体结构破坏[6]．

图3 锌胁迫对狗牙根植株叶绿素（a、b）含量的影响Fig.3Effects of Zn2+stress on chlorophyll（a、b）content in leaves of C. dactylon

2.4 Zn2+胁迫对狗牙根富集锌的影响

从实验可知，当霍格兰德营养液中外源Zn2+浓度增加时，狗牙根茎和根积累Zn2+的量明显增加，而且各处理间差异显著（P < 0.05），见表1．重金属Zn2+通过水体后，通过水体—植物系统进入狗牙根体内．从表1可以看出，狗牙根吸收的锌主要集中在地下部分根．这说明根部积累的锌只有部分转移到地上部分的茎中．与对照组相比，在添加不同浓度Zn2+后，其根、茎中Zn2+质量比差异较明显，其迁移富集量表现为根>茎．因此，狗牙根主要通过根富集重金属离子．

表1 Zn2+在狗牙根植物体内的积累和分布情况1）Tab.1 Zn2+concentration and distribution in C. dactylon under Zn2+stress

1）相同列中含有不同字母作为上标的表示差异显著（P＜0.05）

3 结 论

1）狗牙根的生理特性在低浓度Zn2+胁迫下具有促进作用，表现为：新根数、新芽数、叶绿素含量、SOD活性、POD活性增加，而高浓度Zn2+胁迫对上述指标却有抑制作用，但CAT却相反，其活性表现为降势．可能在锌离子的胁迫下，为了减少重金属的毒害作用，增强植株的抗逆性，只能清除过多的活性氧自由基，在狗牙根叶片细胞内形成了一个应急系统，但是随着Zn2+浓度升高和胁迫时间的延长，Zn2+的毒害作用开始显现．降低抗氧化酶活性，可能是由于Zn2+破坏了．

2）目前狗牙根视为三峡库区消落带环境（土壤、水体）生物修复的首选物种之一．其具有潜在的应用价值，表现在虽然狗牙根不是Zn2+的超积累植物，但狗牙根具有富集Zn2+能力和长期耐干旱和水淹胁迫等优势，可以用于治理被Zn2+污染的环境（土壤、水体）．

[1]张太平，潘伟斌.根际环境与土壤污染的植物修复研究进展[J].生态环境，2003，12（1）：31-36.

[2]谭淑端，张守君，张克荣，等.长期深淹对三峡库区三种草本植物的恢复生长及光合特性的影响[J].武汉植物学研究，2009，27（4）：391-395.

[3]邱喜阳，许中坚，史红文，等.重金属在土壤—空心菜系统中的迁移分配[J].环境科学研究，2008，2l（6）：187-192.

[4]刘云峰，刘正学.三峡水库消落区极限条件下狗牙根适生性试验[J].西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（5）：661-663.

[5]李廷真，付川，余顺慧，等.Cu2+胁迫下三峡库区消落带的狗牙根生长状况及其铜富积效应[J].贵州农业科学，2013，41（7）：184-186.

[6]余顺慧，来守军，付川，等.铜胁迫对三峡库区消落带适生植物狗牙根生理特性和铜积累的影响[J].西南师范大学学报：自然科学版，2013，38（11）：64-69.

[7]余顺慧，黄怡民，潘杰，等.铜胁迫对2种三峡库区消落带适生植物生长及铜积累的影响[J].西南农业学报，2014，27（3）：1196-1201.

[8]潘杰，来守军，黄怡民，等.铅胁迫对2种三峡库区消落带适生植物生长及铅积累的影响[J].江苏农业科学，2014，42（6）：332-335.

[9]李合生.植物生理生化试验原理和技术[M].北京:高等教育出版社，2000.

[10]郝建军.植物生理学试验技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2004.

[11]王爱云，黄姗姗，钟国锋，等.铬胁迫对3种草本植物生长及铬积累的影响[J].环境科学，2012，33（6）：2028-2037.

（责任编辑：张新玲）

Effect of Zn2+Stress on Physiological Characteristics of Cynodon dactylon and its Zn2+Uptake: with Special Reference to Cynodon Dactylon, a Plant Suitable in Three Gorges Reservoir

DONG kaixin ZHANG Shuai WU Jiening YU Shunhui
(Key Laboratory of Water Environment Evolution and Pollution Control in Three Gorges Reservior, Wanzhou, Chongqing 404100, China)

In order to elucidate the toxic mechanisms of Cynodon dactylon under Zinc stress, this paper provides a theoretic foundation for phytoremediation of Zn2+-contaminated water, and screening experiment was conducted to investigate the effects of Zn2+on plant, the new sprout number, the new root number, the contents of chlorophyll, the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxide enzyme (POD), catalase (CAT) in the leaves and Zn2+accumulation and distribution in C. dactylon．The results indicated that the new root and bud number and the chlorophyll content of C.dactylon were increased under lower Zn2+concentrations. However, lower new root, bud number and chlorophyll content were observed for the higher Zn2+concentrations．The activities of SOD, POD were increased under40 mg / l Zn2+, but the activities of SOD, POD were decreased above 40mg / l Zn2+. CAT has been on the decline. Zn2+was distributed firstly in the C. Dactylon of roots and the secondly in the stems. This investigation also showed that C. dactylon could decrease the content of Zn2+in polluted water. The results suggest that C. dactylon be promising for the phytoremediation of Zn2+-contaminated soil and water．

Zn2+stress; Cynodon Dactylon; physiological characteristics; accumulation

Q945.7

A

1009-8135（2015）03-0004-04

2015-02-11

董凯馨（1990-），女，河北张家口人，重庆三峡学院硕士研究生，主要研究生态学.

余顺慧（1964-），女，重庆万州人，重庆三峡学院教授，主要研究生态学.

重庆高校市级重点实验室开放基金项目“三峡库区水环境演变与污染防治”（WEPKL2012MS-01）阶段性成果