立枯丝核菌病原致病性及苜蓿品种抗病性研究

郭玉霞，张 明，管永卓，刘 芳，郭志鹏，张红瑞，严学兵，王成章

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）

立枯丝核菌病原致病性及苜蓿品种抗病性研究

郭玉霞，张 明，管永卓，刘 芳，郭志鹏，张红瑞，严学兵*，王成章

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）

为了探明立枯丝核菌对苜蓿种苗的致病性，本研究采用菌饼上放置种子的方法，将分离自3个地点6个苜蓿品种上的6个菌株接种于14个紫花苜蓿品种的种子上，14 d测定相对发芽率、根长、苗长和病情指数。结果表明，参试菌株的菌降低了种子的发芽，从金皇后分离到的菌株对苗长的抑制作用最强；致病性差异显著（P＜0．05），其中从金皇后分离出菌株的致病性最强，从丰宝中分离出菌株的致病性最弱；从金皇后、8920 MF和爱菲尼特中分离出的立枯丝核菌对苜蓿种子与幼苗的致病力较强；参试的苜蓿品种对同一菌株的抗病性不同，佛拿尔、阿尔冈金和苜蓿王的抗病力最强，丰宝、丰叶721抵抗力最弱。

紫花苜蓿；种苗；立枯丝核菌；致病性；抗病性

苜蓿（Medicago sativa）是世界上栽培最早、分布面积最大的一种多年生优质豆科牧草，产量高，适口性好，被誉为 “牧草之王”［1-2］。苜蓿在我国西部开发、退耕还草、种草养畜、改善生态环境、农区粮—经二元结构向粮—经—饲三元结构调整、奶牛业及草食家畜畜牧业快速建设中发挥着重要作用［3-4］。随着我国草地畜牧业和草产业的发展，苜蓿的种植面积不断增加以及种植年限的延长，苜蓿病害逐渐成为影响苜蓿产量、品质、限制苜蓿广泛应用的主要因素。尤其是苜蓿根腐病已成为苜蓿产量下降和植株衰败的重要原因之一，根腐病的研究及防治已经引起了国内外苜蓿产业的重视［5-9］。

立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）在自然界广泛存在，为无孢科、丝核菌属半知菌真菌，是广泛分布于全世界的一种土壤习居菌，是引起根腐和茎腐症状的重要病原菌，因此被认为是最具破坏力的土传植物病原物之一［10］。在豆类商业领域的产量损失评估中，各个工厂由于立枯丝核菌根腐引起的豆荚和种子数量减少平均分别为59．7%和51．9%［11-12］。在伊朗的桑姜自1998年以来，由丝核菌引起的根腐烂在大豆（Glycine max）产量上已经代表一个不断扩大的问题［13］。立枯丝核菌可引起多种植物种腐、根腐、苗期立枯及茎叶部病害，并能侵害263种以上的植物［14］，包括马唐（Digitaria sanguinalis）、水游草（Leersia hexandra）等多种杂草［10，13］以及水稻（Oryza sativa）［15-16］、马铃薯（Solanum tuberosum）［17］、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare）、小麦（Triticum aestivum）、大豆、茭白（Zizania caduciflora）等，还有苜蓿、沙打旺（Astragalus adsurgen）、百脉根（Lotus corniculatus）、红豆草（Onobrychis viciifolia）、白三叶（Trifolium repens）等多种牧草［18］。曾在甘肃陇东局部地区立枯丝核菌引起的根腐病是草木樨（Melilotus officinalis）毁灭性病害之一，在新疆有些地区从苜蓿根腐或颈腐病株分离的病原物中立枯丝核菌甚至占60%以上［18］。立枯丝核菌在苜蓿上可引发很大的危害，该菌引起苜蓿根腐及叶枯等症状，几乎世界所有的苜蓿种植区均有发生［18-20］。陈雅君和崔国文［21］对黑龙江省紫花苜蓿种植区进行了根腐病调查，确定了致病菌的优势种为镰刀菌（Fusarium spp．）、丝核菌。郭玉霞等［22］在黄土高原区苜蓿与小麦轮作系统根部入侵真菌研究中，以苜蓿侧根为研究材料在生长期分离出的23种真菌中包括立枯丝核菌。在对苜蓿根腐病的以往研究中，多是从病原菌的致病性或品种的抗病性上进行单因素单向试验，目前有关紫花苜蓿与根腐病菌的互作机制尚未见报道，立枯丝核菌对苜蓿种苗方面缺乏系统的研究，因此研究寄主与病原物相互作用机制，对于抗病育种以及抗性分析都具有重要意义。本研究从苜蓿品种的抗病性与病原菌的致病性的互作效应着手，以3个地点6个苜蓿品种上的6个立枯丝核菌菌株为材料接种于14个紫花苜蓿品种的种子上，评价根腐病原菌立枯丝核菌对苜蓿不同品种种苗的影响及苜蓿对立枯丝核菌的抗病性，从而为抗根腐病育种、苜蓿病害防治工作以及建植高产、稳产、优质的人工苜蓿草地、发展当地畜牧业提供基础数据和科学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

将从苜蓿侧根上分离得到的立枯丝核菌分别于PDA培养基上黑暗条件下20℃恒温培养箱培养一周，作为参试菌种（表1）。再用经过灭菌的直径为10 mm的打孔器在菌落边缘钻取3个直径10 mm的菌碟，按Nan［23］的方法，将真菌分离物接种于无菌的玉米粉、石英砂培养基（玉米粉∶石英砂∶水＝5∶100∶20）上培养一周供接种之用。

表1 供试立枯丝核菌菌株及其来源地Table 1 R．solani isolated from alfalfa root-invading and their sources

本实验供试苜蓿品种详见表2。

表2 参试苜蓿品种及其来源Table 2 Testing alfalfa varieties in the experiment and their sources

1．2 接种与测定指标

将苜蓿各品种的种子经75%酒精2 min和1%次氯酸钠5 min进行表面消毒后，用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分后均匀放置于接种于如前述材料已培养好菌落的培养皿中，每皿25粒，每品种与每个菌株的组合为一个处理，每处理设4个重复（培养皿），以未接种菌株的培养皿为空白对照［24］。接种后将培养皿放置在培养箱中，20℃黑暗下培养。在整个培养期间，隔天称量培养皿的重量，补充蒸馏水使之衡重。于接种后第14天统计苜蓿种子发芽数、腐烂种子数，根据如下公式计算相对发芽率：

14 d后测定苜蓿幼苗的苗长、根长，根据如下公式计算相对根长、相对苗长：

根据如下标准统计每株幼苗上的病情指数级别［24］：0．无肉眼可见症状；Ⅰ．根变细；Ⅱ．根部小于1／2的面积出现病斑；Ⅲ．根部大于1／2的面积出现病斑；Ⅳ．全株腐烂；Ⅴ．种子烂死，根据如下公式计算病情指数：

1．3 数据统计分析

用Microsoft Excel进行数据处理，用DPS 6．55 Patch软件对数据进行完全随机双因素有重复统计分析和差异显著性测定。

2 结果与分析

从表3，4，5，6结果可以看出：不同来源地的立枯丝核菌菌种对不同苜蓿品种的病情指数、相对发芽率、相对根长及相对苗长均有显著作用，菌种和苜蓿品种之间有显著的互作作用（P＜0．05）。

2．1 立枯丝核菌对14个紫花苜蓿品种病情指数（DI）的影响

从表3可以看出：和对照相比，参试的6个菌种对各苜蓿品种的致病性均有显著性差异。6个菌种之间比较，对同一个苜蓿品种的DI有差异。例如苜蓿王品种，以4号菌种对其致病性最低，显著低于其他5个菌种（P＜0．05）；其次为6号菌种，显著低于1号菌种和高于4号菌种，但与2，3，5号菌种差异不显著（P＞0．05）；以1号菌种对其致病性最强，显著高于其余5个菌种（P＜0．05）。

同一个菌种接种于不同的苜蓿品种，其致病性对病情指数的影响也有很大的差异。例如6号菌种接种于14个苜蓿品种后，对维多利亚的致病性最弱，其次为丰宝、三得利和苜蓿王，其病情指数显著低于赛迪、WL-323HQ、多叶王和阿尔冈金，和其余品种差异不显著（P＞0．05）；以赛迪的致病性最强，其次为WL-323HQ，其病情指数显著高于其余12个苜蓿品种。再如3号菌种，其中赛迪的病情指数最高，显著高于除WL-323HQ、乐歌和丰叶721之外的其余品种的病情指数（P＜0．05）；以佛拿尔、多叶王和三得利的病情指数较低，均显著低于赛迪、WL-323 HQ、乐歌、丰叶721、阿尔冈金和苜蓿王（P＜0．05），和其余品种的致病性差异不显著（P＞0．05）。

表3 苜蓿种子接种立枯丝核菌14 d时的苜蓿病情指数Table 3 Effect of R．solani on disease index of alfalfa seedlings on the 14th day

因此，从立枯丝核菌的致病性总体来看：从3个地域分离到的6个分离物立枯丝核菌均对苜蓿具有显著的致病作用，其病情指数均显著高于对照，其中1号菌的致病性最强，显著高于其余5个菌种（P＜0．05）；2，3号菌次之，显著高于其余3个菌种（P＜0．05）；5号菌种致病性最弱，显著低于1，2，3号菌种（P＜0．05），和4，6菌种差异不显著（P＞0．05）。从14个苜蓿品种对立枯丝核菌6个菌种的抗性总体来说：以赛迪感病性最强，其病情指数显著高于其余13个品种（P＜0．05）；WL-323HQ、丰叶721和乐歌的感病性也较强（DI较高），显著高于其余10个品种（P＜0．05）；以维多利亚的感病性最弱，显著低于除佛拿尔和苜蓿王以外的所有品种（P＜0．05），佛拿尔、苜蓿王、猎人河及丰宝抗性较强。

2．2 立枯丝核菌对14个紫花苜蓿品种相对根长的影响

从表4可以看出，参试的6个立枯丝核菌菌种对各苜蓿品种的相对根长均有一定的抑制作用，但因品种不同各菌种的致病性也有很大的不同。和对照相比较，6个菌种均显著降低了维多利亚的相对根长（P＜0．05），但各菌种对不同苜蓿品种的相对根长的影响显著性差异很大，例如：WL-323HQ品种，仅4号菌种显著降低其相对根长，其余5个菌种对该品种的相对根长的影响差异均不显著（P＞0．05）；而对于皇冠品种来说，2，3，5，6号菌种均对其相对根长有显著的抑制作用（P＜0．05），只有1，4号菌种对其根长影响不显著（P＞0．05）。

6个菌种之间比较，各菌种对同一个苜蓿品种的相对根长的抑制作用不同。例如对皇冠品种来说，以4号菌种对其相对根长的抑制作用最弱，其次为1号菌种，1，4号菌种接种的皇冠其相对根长显著高于其余4个菌种的皇冠；2，3号菌种接种的皇冠根长最短，但与5，6号菌种差异不显著（P＞0．05）。同一个菌种接种于不同的苜蓿品种，其致病性也有很大的差异。例如4号菌种接种于14个苜蓿品种后，对苜蓿王、盛世和多叶王的抑制作用最弱，显著低于对其余所有品种的抑制作用（P＜0．05）；对维多利亚的抑制作用最强，其相对根长低于WL-323HQ、阿尔冈金、佛拿尔和三得利但不显著（P＞0．05），显著低于其余8个品种（P＜0．05）。

因此，从参试的6个菌种对各苜蓿品种的相对根长的平均数来说，以2，3号菌抑制性较强，其抑制性显著高于其余4个菌种（P＜0．05）；4号菌抑制性较弱，显著弱于1，2，3，6号菌种（P＜0．05），与5号菌差异不显著（P＞0．05）。从14个苜蓿品种对立枯丝核菌6个菌种平均的抗性来说，以苜蓿王的抗性最好，显著高于其余13个品种（P＜0．05）；阿尔冈金的抗性次之，显著高于除赛迪、盛世和佛拿尔以外的其余品种（P＜0．05）；以维多利亚的抗性最差，其平均根长显著低于其余13个苜蓿品种，丰叶721、皇冠、三得利和乐歌的抗性也较差，但与大多数品种差异不显著（P＞0．05）。

表4 苜蓿种子接种立枯丝核菌14 d时的相对根长Table 4 Effect of R．solani of different biology regions on relative root length of alfalfa seedlings on the 14th day

2．3 立枯丝核菌对14个紫花苜蓿品种相对苗长的影响

从表5可以看出，参试的6个立枯丝核菌菌种对各苜蓿品种的相对苗长的抑制作用不同。和对照相比，一些品种，大多数菌种均降低了它们的相对苗长。例如，对于猎人河品种来说，6个菌种均降低了其相对苗长，但只有1号菌种对其相对苗长影响显著。另一些品种，大多数菌种接种后的植株相对苗长无抑制作用。例如三得利和多叶王，分别有5个菌种接种的植株相对苗长高于对照，其中前者2号菌种接种的植株苗长低于对照，但6个菌种接种后的苗长与对照差异均不显著（P＞0．05），后者1号菌种显著降低了苗长（P＜0．05），2号菌种的苗长显著高于对照（P＜0．05），其余菌种接种的多叶王苗长与对照相比差异不显著（P＞0．05）。

表5 苜蓿种子接种立枯丝核菌14 d时的相对苗长Table 5 Effect of R．solani of different biology regions on relative shoot length of alfalfa seedlings on the 14th day

6个菌种对同一个苜蓿品种相对苗长的抑制作用不相同。例如对猎人河和丰叶721品种来说，1号菌种的抑制作用最强，4号菌种的抑制作用最弱，前者接种的植株相对苗长显著低于其余5个菌种，但2，3，4，5，6号菌种接种后的植株间差异不显著（P＞0．05）。同一个菌种接种于不同的苜蓿品种，其致病性也有很大的差异。例如5号菌种给14个苜蓿品种接种后，对大部分品种的致病性均较弱，其中对苜蓿王的致病性最弱，其相对苗长显著高于猎人河、丰叶721和乐歌（P＜0．05），但与其余品种的抑制作用差异不显著（P＞0．05）。

因此，从参试的6个菌种对各苜蓿品种的相对苗长的抑制作用来说，以1号菌种的抑制性最强，显著高于其余5个菌种（P＜0．05）；以2，3号菌种的抑制性次之，显著高于4，5号菌种（P＜0．05），2，3号菌种与6号菌种差异不显著（P＞0．05）；6号菌种的抑制性最弱，次为4号菌种。从14个苜蓿品种对立枯丝核菌6个菌种的抗性总体来说：苜蓿王、多叶王抗性最强，显著高于除三得利、盛世、WL-323 HQ和佛拿尔以外的所有品种；猎人河、皇冠、丰宝的抗性最差，相对苗长最低，乐歌、阿尔冈金、赛迪及丰叶721对各菌种的抗性较差。

2．4 立枯丝核菌对14个紫花苜蓿品种相对发芽率的影响

从表6可以看出：参试的6个立枯丝核菌菌种对各苜蓿品种的相对发芽率有不同程度的影响。其中：对部分品种来说，6个菌种对其相对发芽率几乎无影响，如佛拿尔、苜蓿王、盛世、阿尔冈金、皇冠、维多利亚和猎人河，均与对照差异不显著（P＞0．05）。对部分苜蓿品种，只有个别菌种接种的植株和对照的相对发芽率差异显著（P＜0．05），如乐歌、丰宝和多叶王，分别以3，4和6号菌种显著降低其相对发芽率，其余菌种接种的植株均和对照差异不显著（P＞0．05）。个别苜蓿品种，和对照相比，大多数菌种接种的植株差异均显著（P＜0．05），如6个菌种均显著降低了丰叶721和赛迪的相对发芽率（P＜0．05）。

6个菌种之间比较，对同一个苜蓿品种的相对发芽率的抑制作用因品种不同而有所差异。例如对丰宝来说，6号菌种接种的该品种相对发芽率显著低于其余5个菌种，1～5号菌种对其相对发芽率的抑制作用之间差异不显著（P＞0．05）；再如赛迪品种，6个菌种均显著降低了赛迪的相对发芽率，以6号菌种的影响最大，与各菌种均差异显著（P＜0．05）。同一个菌种接种于不同的苜蓿品种，其对发芽率的影响也有很大的差异。例如4号菌种，对丰叶721、WL-323HQ和三得利的抑制作用最强，其相对发芽率均显著低于除多叶王和赛迪的其余9个苜蓿品种。再如1号菌种，对丰叶721、赛迪的相对发芽率的抑制作用最强，其相对发芽率显著低于其余12个苜蓿品种；多叶王、WL-323HQ和猎人河次之，但和其余品种的相对发芽率差异不显著（P＞0．05）。

表6 苜蓿种子接种立枯丝核菌14 d时的相对发芽率Table 6 Effect of R．solani of different biology regions on relative germination of alfalfa seedlings on the 14th day

参试的6个立枯丝核菌菌种对各苜蓿品种的相对发芽率的平均抑制作用相近，其中大多数菌种之间差异不显著，只有6号菌种的抑制性显著高于其余菌种（P＜0．05）。从14个苜蓿品种对立枯丝核菌6个菌种的总体抗性来说：佛拿尔、苜蓿王、盛世、阿尔冈金和维多利亚的相对发芽率高，显著高于除丰宝、皇冠、猎人河和乐歌以外的其余品种（P＜0．05），赛迪、丰叶721、WL-323 HQ、三得利和多叶王相对发芽率较低，对各菌种的抗性较差。

3 结论与讨论

3．1 立枯丝核菌的致病性

立枯丝核菌对苜蓿的相对根长、相对苗长、相对发芽率、病情指数均有不同程度的影响，轻者使幼苗根部褪绿、变细，重者使植株腐烂或种子烂死，致病性结果与陈雅君和崔国文［21］、郭玉霞等［22］、李春杰和南志标［24］、Galindo等［25］、Hancock［26］、李敏权等［27］、Aguirre等［28］的研究结果相一致。不同立枯丝核菌菌株的致病力存在差异，彭绍裘等［15］、邓先明［16］、张君成等［29］、杨金红等［30］、王艳丽等［31］在苜蓿上已有研究，在其他作物上也有类似的报道［15-16，29，32］。

3．2 苜蓿品种的抗病性

Michaud和Richard［33］研究了14个紫花苜蓿品种对根和根颈腐烂病的田间抗性及其抗性的差异，结果显示：所有品种都感染了根腐病，但品种间抗病性差异显著，抗寒品种的根腐烂程度低于中等抗寒品种，发病最轻的产量最高，发病最重的品种产量最低。陈申宽和姚国君［34］在田间自然感病条件下对苜蓿的12个品种进行了抗性评价，结果不同苜蓿品种间抗性存在较大差异，但有些品种抗性不稳定可能是受不同年份气候条件的影响。李敏权［35］通过对20个苜蓿品种幼苗测定各品种对根和根颈腐烂病的抗性，发现存在差异。本结果与上述前人研究结果相一致。

另外，苜蓿根腐病的发生和流行最关键的影响因素是土壤湿度，它不仅影响病菌的生长发育，而且对寄主的生长、病原菌与寄主之间的相互作用都有显著的影响［5］。Nyvall［36］研究发现：潮湿的土壤或土壤含水量为70%～80%时，易发生丝核菌根腐病，表明苜蓿的生长是由包括病原物、土壤水分、微量元素、作物的轮作次序等多种因素共同影响决定的［37-44］。

综上所述，根据DI、相对发芽率、相对根长及相对苗长各项测定的指标综合评定，1，2，3号立枯丝核菌菌株对各苜蓿种子与幼苗致病性较强；而4，5，6号立枯丝核菌菌株对各苜蓿种子与幼苗致病性较弱。苜蓿王、佛拿尔、盛世、维多利亚及阿尔冈金对立枯丝核菌的抗性较强，赛迪、丰叶721、乐歌、皇冠及三得利抗病性较弱。因此应根据同一品种对不同菌种的抗病性和同一菌种对不同苜蓿品种的致病性的综合指标进行品种选择。

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Pathogenicity of Rhizoctonia solani to alfalfa seedlings and disease resistance of alfalfa varieties

GUO Yu-Xia，ZHANG Ming，GUAN Yong-Zhuo，LIU-Fang，GUO Zhi-Peng，ZHANG Hong-Rui，YAN Xue-Bing*，WANG Cheng-Zhang
College of Animal and Veterinary Science，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China

The aim of this study was to evaluate the pathogenicity of Rhizoctonia solani isolates to various alfalfa（Medicago sativa）varieties．We used 14 varieties of alfalfa and six pathogen isolates that were isolated from roots of six different alfalfa varieties from three locations．We estimated the disease index，relative germination rate，relative root length，and relative seedling length at 14 days after inoculation with the various isolates．There were significant differences among the 14 alfalfa varieties inoculated with the six pathogen isolates（P＜0．05）．The isolate from‘Goldenqueen’showed significantly stronger pathogenicity（P＜0．05）than the other isolates．The isolate from‘Powerplant’showed the weakest pathogenicity．All the fungi used in this study resulted in lower germination rates and shorter roots of alfalfa seedlings，and the isolate from‘Goldenqueen’showed the strongest effects．Based on the comprehensive evaluation of all traits，R.solani isolated from‘Goldenqueen’，‘8920MF’，and‘Affinity’showed the strongest pathogenicity to alfalfa seedlings．Among the 14 alfalfa varieties，‘Vernal’，‘Algonguin’，and‘Alfaking’were more resistant to R.solani，while‘Powerplant’and‘Amerileaf 721’were the most sensitive．

alfalfa；seedling；Rhizoctonia solani；pathogenicity；resistance

10．11686／cyxb2015197 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

郭玉霞，张明，管永卓，刘芳，郭志鹏，张红瑞，严学兵，王成章．立枯丝核菌病原致病性及苜蓿品种抗病性研究．草业学报，2015，24（11）：72-81．

GUO Yu-Xia，ZHANG Ming，GUAN Yong-Zhuo，LIU-Fang，GUO Zhi-Peng，ZHANG Hong-Rui，YAN Xue-Bing，WANG Cheng-Zhang．Pathogenicity of Rhizoctonia solani to alfalfa seedlings and disease resistance of alfalfa varieties．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（11）：72-81．

2015-04-16；改回日期：2015-06-10

国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAD17B04），河南省高等学校重点科研项目（15A230019）和牧草产业技术体系项目（CARS-35）资助。

郭玉霞（1975-），女，河南周口人，博士。E-mail：yuxiaguo＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：yxbbjzz＠163．com