抑制CD24基因对膀胱癌细胞生物学行为的影响

施云峰, 莫乃新, 吕 忠, 吴 斌, 史红雷，王旭刚

(江苏大学附属武进医院泌尿外科,江苏常州 213002)

·基础研究·

抑制CD24基因对膀胱癌细胞生物学行为的影响

施云峰, 莫乃新, 吕 忠, 吴 斌, 史红雷，王旭刚

(江苏大学附属武进医院泌尿外科,江苏常州 213002)

目的 利用特异性siRNA沉默CD24基因表达，探讨CD24的表达抑制对体外膀胱癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法 利用脂质体转染法将含有CD24特异性siRNA的真核表达质粒转染至人膀胱癌T24细胞中，实时定量PCR和Western blot法检测T24细胞中CD24基因的表达情况，MTT法、划痕实验、Transwells侵袭实验分别检测调控CD24的表达对体外膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭作用的影响。结果 我们成功建立CD24 siRNA转染的膀胱癌T24细胞株。经实时定量PCR和Western blot法证实siRNA组较空载体组细胞CD24 mRNA转录和蛋白表达水平明显降低。MTT检测发现siRNA组较空载体组细胞的增殖能力显著下降。划痕实验提示siRNA组细胞的迁移能力显著降低；Transwells侵袭实验显示siRNA组的穿膜细胞数显著少于空载体组。结论 特异性siRNA沉默CD24基因表达能显著抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，同时明显抑制其体外侵袭能力。

膀胱癌；细胞增殖；侵袭；RNA干扰

早期膀胱癌可以通过手术获得较好的疗效，但是发生转移的晚期膀胱癌的治疗仍是临床的难点，针对膀胱癌转移的基础研究具有积极的意义。有研究发现CD24 高表达于多种肿瘤细胞膜上，并与肿瘤的转移及预后密切相关[1]。在诱导的膀胱癌研究模型中，CD24基因敲除小鼠发生肿瘤的比例明显较对照组低，而且肿瘤的侵袭和转移能力减弱[2]。因此我们拟采用RNA干扰技术阻断CD24在膀胱癌T24细胞中的作用，以观察肿瘤细胞的生长变化情况，并探讨其变化机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 膀胱癌T24细胞株购自中科院上海细胞研究所，CD24 siRNA真核表达质粒和空载体由上海吉玛公司构建并测序鉴定，脂质体细胞转染试剂 LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；胎牛血清和RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司，CD24单克隆抗体购自美国Sigma公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自杭州华安生物公司，Transwells小室购自美国Costar公司，BCA蛋白定量试剂盒和ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染 膀胱癌T24细胞采用RPMI-1640加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的培养液，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养，用0.25%的胰酶消化传代。取对数生长期细胞以2×105个接种于6孔板中，继续培养，观察细胞生长至60%～80%融合时开始转染，按照LipofectamineTM2000说明转染，共分3组，分别为空白对照组(未做处理)、阴性对照组(转染无义siRNA)、CD24-siRNA组(转染CD24 siRNA)，每组设置3个复孔。

1.2.2 实时定量PCR检测CD24 mRNA的表达 转染后48 h收集细胞，提取各实验组细胞总RNA，取1 μg逆转录到cDNA。CD24引物序列由上海英俊公司合成，CD24上游引物：5′- AAAGAAATGGCTGAAAGAGCAA -3′，下游引物：5′- AGGCTCATAGAACCATGATTACCC -3′，内参β-actin上游引物：5′- GTGATGGTGGGAATGGGT -3′，下游引物：5′- TGGGGTGTTGAAGGTCTC -3′。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s；72 ℃ 20 s，共40个循环，然后采用2e -△△Ct相对定量比较各组差异。

1.2.3 Western blot检测 收集转染后96 h的细胞，用裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后按60 μg/孔上样后电泳。4 ℃ 100 V转膜1.5 h至PVDF膜上，PVDF用5%脱脂奶粉TBST液封闭45 min，加入鼠抗人AR单抗(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。然后再加入HRP标记的二抗(1∶3 000稀释)孵育1 h，ECL检测试剂盒显色，曝光。图像扫描后用BandScan软件作灰度分析。

1.2.4 MTT实验 转染后的细胞调整浓度为4×103个/孔，种植于96孔板，将细胞放于37 ℃培养箱、5% CO2、饱和湿度条件下培养。每组细胞设3个平衡孔，分别于0、24、48、72 h后，吸去多余培养基，然后加入80 μL新鲜培养基，加入20 μL MTT、37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养4 h；吸去培养基，加入150 μL DMSO，避光置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪A590 nm处测量各孔的A值。

1.2.5 Transwell侵袭实验 将Matrigel基质胶与含0.1%BSA的1640液按1∶8比例混合后于37℃包被Transwell小室6 h，然后用50 μL含0.1%BSA的1 640液水化小室30 min。收集转染48 h的细胞，分组同前，重悬浮后以每孔2×104接种于Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%血清培养基，置于孵箱培养24 h。取出Transwell小室，PBS洗涤以4%多聚甲醛固定30 min，棉签擦去上室未穿膜的细胞，后用结晶紫染色30 min，显微镜下随机选取5个视野，计数整个视野内穿膜至下面的细胞数，计算平均值。

1.2.6 划痕实验 将转染后的细胞消化接种至6孔板内。待细胞融合度达100%后，在6孔板背部，均匀划出横线，用PBS清洗细胞3次，去除漂浮的细胞，加入含2%FBS的1640培养基。培养24 h后，沿划痕边缘等距离取5个数据测定点以 Image J软件测定细胞间距，测量后取平均值。细胞迁移比例用如下公式计算：100%-(24 h后的宽度/实验开始时的宽度)×100%。

2 结 果

2.1 特异性siRNA作用对CD24基因表达的影响 与空白组比较，阴性对照组和siRNA组的CD24 mRNA相对表达水平分别为1.083±0.21、0.375±0.09。蛋白印迹检测显示siRNA组CD24蛋白的表达明显低于其他两组(P<0.05,图1、图2)。

图1 CD24 mRNA在各组的相对表达量

A:柱状图；B:荧光显微镜下，绿色荧光蛋白在细胞中广泛表达，表明CD24 siRNA和无义siRNA已成功转入细胞(×100)。

2.2 CD24表达抑制对细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验显示，转染CD24-siRNA后的细胞迁移能力显著降低(F=278.45，P=0.000)，siRNA组迁移比例为[(38.9±4.85)%]较对照组[(73.5±9.51)%]、空白对照组[(75.83±11.24)%]明显降低(P=0.000)。

2.3 抑制CD24基因表达对膀胱T24癌细胞增殖作用的影响 通过MTT法检测发现，siRNA组细胞的吸光度值显著低于其他两组，多个时间点的差异均有统计学意义(P<0.05)，随着监测时间延长，生长抑制作用加剧(图3)。

图2 CD24蛋白在各组的表达

1.空白对照组;2.阴性对照组;3.siRNA组。

图3 MTT实验检测细胞在各组中的增殖情况的变化

*与其他组比较，P<0.05。

2.4 抑制CD24基因表达对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响 Transwells侵袭实验结果显示，siRNA组穿膜细胞数(58.9±19.7)与空白对照组(163.4±25.5)及阴性对照组(161.3±18.7)相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,图4)。

图4 Transwells侵袭实验检测细胞的侵袭能力变化(×100)

A:空白对照组;B:阴性对照组;C:siRNA组。

2.5 调控CD24基因表达对膀胱癌T24细胞内相关蛋白的影响 蛋白印迹法检测显示，siRNA组细胞中的细胞周期蛋白Cyclin D1、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9均有明显降低(图5)。

图5 各组细胞中细胞周期蛋白Cyclin D1、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达

3 讨 论

CD24为一种膜糖蛋白，是P-选择素的配体之一，在正常生理情况下，参与介导单核细胞、中性粒细胞与表达P-选择素的内皮细胞、血小板之间的粘附[3]。近年来，临床研究发现CD24 高表达于多种肿瘤细胞膜上，并与肿瘤的转移及预后密切相关，已证实了CD24与乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等多种肿瘤的发生发展相关[4]。曹晓锋等[5]研究CD24可能参与了膀胱尿路上皮肿瘤的血管生成，促进膀胱肿瘤的浸润和转移，CD24的高表达是肿瘤的浸润性和高分级的标志。LEE等[6]研究显示在胰腺癌、结肠癌、肝细胞癌中CD24阳性细胞群具有自我更新、分化和转移的能力。

我们在实验中针对CD24基因mRNA特点设计合成siRNA分子，转染至膀胱癌T24细胞。通过检测，发现转染后细胞内CD24基因mRNA水平及蛋白质水平均明显下降，说明转染成功抑制了CD24的表达。后续的MTT实验、细胞划痕实验及Transwell实验显示转染组细胞增殖、迁移和侵袭能力均较空白对照组和阴性对照组显著减弱。为初步探讨细胞转染后发生生长状态变化的原因，我们的进一步研究提示，在转染组细胞中，CD24表达抑制后细胞内细胞周期相关蛋白(Cyclin D1)和基质金属蛋白(MMP-2、MMP-9)的表达降低，细胞的增殖和侵袭能力降低可能与此有关。siRNA干扰组T-24细胞MMP-2、MMP-9的分泌量显著低于对照组细胞，这是可能是由于封闭CD24后阻断了肿瘤细胞自分泌产生MMPs的结果[7]。OVERDEVEST等[8]通过对比研究膀胱癌的原发瘤及转移瘤，发现CD24在转移瘤中高表达，裸鼠实验中，运用单克隆抗体抑制CD24后，发现能显著抑制肿瘤的生长，并延长裸鼠生存期。这些都表明CD24在膀胱癌的转移进展中可能具有重要的作用。

本研究提示CD24在膀胱癌细胞生长调控中发挥关键的作用，深入研究CD24的具体作用机制以及其参与介导的相关信号通路变化，对以CD24为新靶点的膀胱癌基因生物治疗研究具有积极的意义。

[1] SMITH SC, OXFORD G, WU Z, et al. The metastasis -associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer[J]. Cancer Res,2006,66:1917-1922.

[2] OVRRDEVEST JB, KNUBEL KH, THEODORESCU D, et al. CD24 expression is important in male urothelial tumorigenesis and metastasis in mice and is androgen regulated[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(51):E3588-3596.

[3] 邹萌萌，吴诚义．CD24 与乳腺癌及其干细胞的研究进展[J]．中国普通外科杂志，2008,17(5)：480-483．

[4] SAGIV E, STARR A, ROZOVSKI U, et al. Targeting CD24 for treatment of colorectal and pancreatic cancer by monoclonal antibodies or small interfering RNA[J]. Cancer Res, 2008,68:2803-2812.

[5] 曹晓锋，段建敏，魏希锋，等. 膀胱尿路上皮癌中CD24、VEGF、MVD的表达及其临床意义[J].现代泌尿外科杂志，2009,14(2):118-120.

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[7] 薛义军，孙志熙，邹晓峰，等.小RNA干扰沉默CD147基因对膀胱癌T-24细胞生物学行为的影响[J].肿瘤，2012，32(5)：342-348．

[8] OVERDEVEST JB, THOMAS S, KRISTIANSEN G, et al. CD24 offers a therapeutic target for control of bladder cancer metastasis based on a requirement for lung colonization[J]. Cancer Res, 2011,71(11):3802-3811.

(编辑 何宏灵)

Effects of downregulation of CD24 gene expression on malignant biological behavior of bladder cancer cells

SHI Yun-feng, MO Nai-xin, LÜ Zhong, WU Bin, SHI Hong-lei, WANG Xu-gang

(Department of Urology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou 213002, China)

Objective To investigate the effects of CD24 knockdown by siRNA on bladder cancer cell proliferation, apoptosis and invasion. Methods CD24 siRNA plasmids were constructed, and then transfected into T24 cells. The mRNA and protein levels of CD24 expression in the transfected cells were detected using qRT-PCR and Western blot assay. The proliferation, migration and invasion of bladder cancer cells were observed with MTT, scratch test and Transwells assays. Results The mRNA and protein levels of CD24 expression in the siRNA group were significantly decreased compared with the control group. The proliferation of CD24 siRNA cells decreased notably compared with the control group, and the migration ability was reduced. The number of invasive T24 cells in the siRNA group decreased compared with the control group. Conclusions Downregulation of CD24 by siRNA inhibits bladder cancer cell proliferation, induces apoptosis and weakens its invasive ability in vitro.

bladder cancer; cell proliferation; invasion; RNA interference

2014-12-24

2015-04-06

常州市武进区科技计划项目(No.WS201316)

施云峰(1983-)，男(汉族)，硕士，主治医师.研究方向：泌尿生殖系统肿瘤基础与临床.E-mail: fzy8353@163.com

R737.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.08.018