三氧化二砷联合环杷明协同抑制PC3细胞生长及其机制的实验研究

熊永江，刘纯青，戴志红，董相权，刘志宇

(1.重庆医科大学附属永川医院泌尿外科，重庆 402160；2.大连医科大学检验学院，辽宁大连 116044；3.大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁大连 116027)

·基础研究·

三氧化二砷联合环杷明协同抑制PC3细胞生长及其机制的实验研究

熊永江1，刘纯青2，戴志红3，董相权3，刘志宇3

(1.重庆医科大学附属永川医院泌尿外科，重庆 402160；2.大连医科大学检验学院，辽宁大连 116044；3.大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁大连 116027)

目的 探讨三氧化二砷(ATO)联合环杷明(cyclopamine，CYA)对非雄激素依赖前列腺癌PC3细胞增殖的影响及其分子学机制。方法 采用MTT比色法检测不同浓度ATO及CYA单独或联合治疗对不同时间点PC3细胞生长的抑制作用。应用裸鼠致瘤实验进一步验证ATO联合CYA对PC3细胞生长的影响。Western blot检测ATO联合CYA对PC3细胞内Hedgehog(Hh)信号通路中重要蛋白Smoothened(Smo)、Patched (Ptch)及GLI1的影响。结果 ATO或CYA抑制PC3细胞生长呈现明显的剂量及时间依赖性，且两药联合对PC3细胞生长有协同杀伤作用。动物实验进一步证实ATO联合CYA较单剂量组更能明显抑制PC3细胞移植瘤的生长(P<0.05)。Western blot 结果证实ATO和CYA联合较单剂量组更明显下调Smo、Ptch及GLI1的表达。结论 ATO联合CYA能协同抑制PC3细胞的生长，其机制可能是两药联合协同下调PC3细胞中Hh信号通路的表达。

前列腺癌；PC3细胞；三氧化二砷；Hedgehog信号通路

前列腺癌(prostatic cancer, Pca)在西方国家位居男性恶性肿瘤之首，近年来我国Pca的发病率亦大幅提升，虽然治疗水平已有明显提高，但是大多数患者将在较短时间里发展成为非雄激素依赖Pca，而对此阶段的Pca尚无确切有效的治疗手段[1]。因此，探索非雄激素依赖Pca的发生机制及有效的治疗药物是目前临床迫切需要解决的问题。Hedgehogh(Hh)信号通路在非雄激素依赖前列腺癌的发生发展中具有重要作用[2]。最近BEAUCHAMP等[3]研究表明三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)可以通过下调GLI1基因阻滞尤文肉瘤和成神经管细胞瘤细胞生长，提示ATO对Hh信号通路异常激活的恶性肿瘤具有潜在的抗癌作用。在二期临床试验中单用ATO对一些实体瘤如转移性肾细胞癌疗效比较有限[4]。但是，高剂量的ATO用于实体瘤的治疗伴随着较高临床风险[5]。因此，ATO与其他化疗药的联合治疗将是一个很好的策略，以达到增效减毒的作用。最近BEACHY等[6]以ATO联合环杷明(cyclopamine, CYA)治疗已经转染GLI信号的小鼠成纤维细胞(NIH3T3 fibroblasts cells)，发现作用于Hh通路不同位点的两种药物联合能够明显降低药物剂量，但对Hh通路产生了更为显著的阻滞作用。

基于上述研究基础，我们提出ATO与Smoothened (Smo) 特异的拮抗剂CYA联合应用治疗非雄依赖的Pca的设想。本研究选取非雄依赖的Pca细胞株PC3细胞，通过体外细胞培养及裸鼠实验，观察ATO及CYA单独及联合应用对PC3细胞增殖的影响，并进一步探讨其内在细胞分子机制，以明确ATO联合CYA对非雄依赖Pca的潜在治疗效果。

1 材料与方法

1.1 主要药物及试剂 人前列腺癌PC3细胞株购于中科院上海细胞生物学研究所细胞库。裸鼠购买并饲养于大连医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(辽)2013-0006，三氧化二砷注射液购自哈尔滨伊达药业有限公司；Cyclopamine(粉剂)，购自美国LC实验室；Ptch、Gli1、Smo、抗体购于美国Abcam公司。

1.2 细胞培养 PC3细胞用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Ham’S F12培养基培养，置于5% CO2培养箱、37 ℃饱和湿度培养，待细胞对数生长期进行药物干预。

1.3 MTT法检测细胞活性 消化并收集PC3细胞，以1×106/mL培养液稀释,按照200 μL/孔接种于无菌96孔培养板，不同浓度的ATO (2.5、5、10、20 μmol/L)和不同浓度的CYA (4、8、16、32 μmol/L)及两者联合给药，同时设立对照组为参照，每个浓度3个复孔，分别处理24、48 及72 h后加入MTT 20 μL，继续孵育4 h后弃上清，加入200 μL DMSO轻微震荡10 min，酶标仪测490 nm A值，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4 前列腺癌裸鼠实验 调整对数生长期PC3细胞浓度为1×107/mL，吸取50 μL Matrigel置于冰上，加入50 μL单细胞悬液，混匀，迅速接种于裸鼠左前肢近腋窝皮下。每周以游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为：肿瘤大小=长×宽×宽×0.5[7]。裸鼠24只，SPF级，雄性，5～6周龄，体重18～20 mg，随机分为4组，每组6只。设立空白对照组，治疗组分别以ATO(5 mg/kg)、CYA (16 mg/kg)、及两者联合给药、隔日一次腹腔注射，共治疗5周。

1.5 Western blot检测 ATO 2.5 μmol/L、CYA 8 μmol/L单用及联合分别治疗PC3细胞48 h后收集细胞，提取蛋白质，测定蛋白浓度，配胶，加样，浓缩胶60 V、分离胶 120电泳至条带明显分开，转膜约90 min，5%牛奶封闭2 h，TBST清洗3次，然后一抗4度孵育过夜，次日二抗常温孵育2 h，TBST清洗3次后于暗室ECL发光，暗盒曝光，显影，定影，拍照。

2 结 果

2.1 ATO与CYA协同抑制PC3细胞生长 ATO和CYA均能抑制PC3细胞的生长，且呈现出明显的剂量及时间依赖性( 图1A、1B)。在此基础上，本研究选取2.5 μmol/L ATO联合8 μmol/L CYA治疗PC3细胞(图1C)，24 h抑制PC3细胞达25.2%，与2倍剂量的ATO(21.5%，P>0.05)或CYA (28.3%，P>0.05)效果类似，但明显优于单剂量ATO(8.5%，P<0.05)或CYA(5.9%，P<0.05)；48 h抑制PC3细胞达48.9%，明显优于2倍剂量的ATO(38.7%，P<0.05)或CYA (32.6%，P<0.05)；72 h抑制PC3细胞达55.7%，尽管效果也优于2倍剂量的ATO(49%)或CYA(40.7%)，但统计学分析差异并不显著(P>0.05)。

应用Chou’s公式[8]对两药是否具有协同作用进行分析，结果显示2.5 μmol/L ATO联合8 μmol/L CYA治疗24、48及72 h其联合指数(combination index value，CI)均小于1，提示ATO和CYA联合化疗具有协同作用。

2.2 ATO与CYA联合应用对PC3细胞致瘤裸鼠移植瘤的抑制作用 各组肿瘤体积在0～10 d内无明显差异，第17天三个治疗组肿瘤体积和对照组比较开始下降，第24天可观察到明显差异，第31天差异进一步扩大，治疗结束时ATO治疗组、CYA治疗组以及联合治疗组与对照组比较均能显著阻滞PC3细胞移植瘤生长，抑瘤率分别为35.4% (P<0.05)、39.5%(P<0.05)和79.1% (P<0.05) (图2A、2C)，且联合治疗组的移植瘤体积明显低于两个单剂量药物组(P<0.05,图2B)。同样，各组肿瘤重量与肿瘤体积结果相似(图2D)。

图1 MTT比色法检测ATO、CYA及其联合应用对PC3细胞生长的抑制作用

A：ATO(呈时间和剂量依赖性)；B：CYA(呈时间和剂量依赖性)；C：ATO和CYA协同抑制作用。与对照组比较,*P<0.05，与联合组比较,#P<0.05。

图2 ATO联合CYA对PC3细胞致瘤裸鼠移植瘤的抑制作用

A:移植瘤位置；B:移植瘤体积折线图；C:移植瘤大体观；D:移植瘤质量柱状图。与对照组比较，*P<0.05；与单剂量药物组比较，#P<0.05。

2.3 ATO与CYA联合治疗对PC3细胞内Hh信号通路重要蛋白表达的影响 为了探索ATO与CYA协同抑制PC3细胞生长的机制，我们通过Western blot检测Hh信号通路中Smo、Ptch及Gli1蛋白的表达情况，结果显示ATO治疗组Ptch及Gli1表达水平降低，对Smo的表达无明显影响；联合治疗组Ptch及Gli1表达进一步降低；与对照组比较均明显下调，同时联合治疗组与ATO及CYA单剂量药物组比较进一步下调Ptch及Gli1蛋白表达(图3)。

图3 Western blot检测ATO联合CYA对PC3细胞内Hh信号通路中重要蛋白Smo、Ptch及GLI1的影响

3 讨 论

Hh信号通路是调节胚胎正常发育过程中各种组织生长必不可少的信号通路之一,其主要功能为控制细胞增殖。Hh信号通路受细胞跨膜蛋白Ptch及Smo控制，当Hh和细胞膜上的接收器Ptch结合时，释放被Ptch抑制的跨膜蛋白Smo，然后激活的Smo诱导增强下游的GLI的活性，故有研究者将Hh信号通路形象的称为Hh-Gli通路。前列腺癌的进展是一个复杂的过程，涉及变异的细胞信号传导途径。 Hh信号通路是这样的途径之一，越来越多的证据表明Hh信号通路异常激活在前列腺癌的发生发展中起着重要的作用[2, 9]。

本研究通过体内外实验证实了ATO联合CYA可以明显抑制非雄激素依赖前列腺癌PC3细胞生长，且具有协同作用(CI<1)。我们进一步探讨ATO和CYA协同作用可能存在的分子机制。众所周知，ATO治疗急性粒细胞白血病具有较高的完全缓解率，主要是作用于PML/RAR蛋白的锌指结构[10]。同样GLI家族亦有锌指结构，HAN等学者通过体内外实验研究发现ATO可以结合GLI1锌指结构蛋白而抑制胰腺癌细胞的生长[11]。在本研究中，CYA以及ATO单独处理PC3细胞分别主要减少Smo和GLI的表达，这与先前的研究结果一致。此外，我们的结果表明，ATO和CYA联合治疗和单一药物治疗比较能够显著抑制GLI1蛋白的表达。在Hh通路，Ptch不仅是一种通路阻滞剂的受体，而且作为这条通路的靶基因，形成负反馈机制，以维持Hh信号通路活性在适当水平[12]。为了进一步说明的ATO联合CYA对Hh通路的作用，我们对Ptch蛋白表达进行检测。Ptch的表达水平在ATO、CYA及联合治疗组均下降，其中在联合用药组下降最为明显。相似地，KIM等[13]研究发现伊曲康唑和ATO主要作用为分别抑制Smo/GLI蛋白，联合应用时对Smo拮抗剂已产生耐药的成神经管细胞瘤细胞同样有着叠加抑制Hh信号通路活性以及肿瘤细胞生长的作用。综上所诉，这种多靶点治疗有助于协同抗癌作用。

激素非依赖性Pca目前无确切有效的治疗药物及手段，而癌细胞的增殖扩散则常常是导致患者最终死亡的重要原因。本实验证实了ATO联合CYA能协同抑制PC3细胞的增殖，主要通过下调Hh信号通路活性，为今后可能的临床应用提供了一定的实验依据。

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(编辑 何宏灵)

An experimental study on synergism between arsenic trioxide and cyclopamine in the inhibition of PC3 cell survival and its mechanisms

XIONG Yong-jiang1, LIU Chun-qing2, DAI Zhi-hong3, DONG Xiang-quan3, LIU Zhi-yu3

(1. Department of Urology, Yongchuan Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 402160, China; 2. College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, Dalian 116044; 3. Department of Urological Surgery, Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China)

Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (ATO) alone and in combination with cyclopamine (CYA) on the proliferation of PC3 cells and to further explore its molecular mechanism. Methods PC3 cells were treated with different concentrations of ATO and CYA alone or in combination for different periods, and cell viability was analyzed with MTT assay. PC-3 xenograft model was used to further investigate the antiproliferative effects of ATO combined with CYA. The expressions of Hh target genes Ptch, Smo, and Gli1 were determined by Western blot. Results The results of MTT displayed that ATO or CYA alone reduced the viability of PC3 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner and exhibited a synergism. Combined treatment of the cells with ATO and CYA dramatically increased antiproliferative effects in nude mice compared with ATO or CYA treatments alone (P<0.05). The combined treatment of ATO and CYA was much more effective than CYA or ATO alone in terms of down-regulating the Ptch, Smo, and Gli1 expressions in PC3 cells. Conclusions ATO showed synergism with CYA in inhibiting the growth of PC3 cells. The exact mechanism may involve downregulation of Hh pathway.

prostatic cancer; PC3 cells; arsenic trioxide; hedgehog signaling pathway

2015-01-30

2015-04-08

刘志宇，博士，主任医师. E-mail：letter89@163.com

熊永江(1988-)，男(汉族)，医师，医学硕士.主要从事泌尿外科基础与临床研究.E-mail：xiongyongjiang1988@126.com

R34

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.08.017