灵芝孢子粉抑制人卵巢癌细胞增殖及诱导凋亡的体外研究

王卫霄 姚苗苗 吕艳茹 杜晓欣 张晓静 赵素芬

·论著·

灵芝孢子粉抑制人卵巢癌细胞增殖及诱导凋亡的体外研究

王卫霄 姚苗苗 吕艳茹 杜晓欣 张晓静 赵素芬

目的研究灵芝孢子粉对人卵巢癌OV2008细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法采用WST-1比色法及显微镜观察法研究灵芝孢子粉对OV2008细胞生长抑制作用及细胞形态的改变;流式细胞仪检测细胞周期分布情况;Hoechst-33258染色方法评估细胞凋亡并采用western blot方法测定凋亡相关蛋白的表达。结果WST结果表明灵芝孢子粉可以抑制OV2008细胞的生长，并呈剂量和时间依赖性;流式细胞术结果提示灵芝孢子粉可使卵巢癌细胞生长阻滞于G1期。Hoechst-33258染色结果显示灵芝孢子处理细胞后可以检测出凋亡细胞。Western blot方法检测到凋亡抑制蛋白bcl-2、bcl-xl随灵芝孢子浓度增加而下降，而促凋亡蛋白bax及P27、casep具有抑制卵巢癌细胞生长及诱导凋亡的作用，其机制是作用于细胞周期的ase-3逐渐升高。结论灵芝孢子粉可以抑制卵巢细胞生长，使细胞生长阻滞于G1期，并可以通过上调bax、P27，下调bcl-2并活化casepase-3而发挥其作用。

灵芝孢子粉;卵巢肿瘤;增殖;凋亡;细胞周期

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其治疗以手术和化疗为主。随着治疗手段的提高，患者的生存率和生活质量也得到了一定程度的提高，但由于治疗效果仍不十分理想，其病死率仍居妇科恶性肿瘤之首。因此寻求有效的治疗方法仍然是卵巢癌的研究焦点。目前中药作为卵巢癌辅助治疗手段之一越来越受到重视。灵芝孢子在我国及其他亚洲国家已被公认为治疗

多种疾病的中药，并且已有大量应用灵芝孢子治疗各种肿瘤的研究报道［1-3］。本研究观察了在不同药物浓度下灵芝孢子对体外培养人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响，探讨其对人卵巢癌OV2008细胞生长抑制作用的机制，为其在卵巢癌的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器:NU2600E型CO2培养箱(ESBE Scientific MC017A1C);超净工作台(Microzone coinporation F40BX/SPZ41);EL340酶标仪(Bio.TEK INSTRUMENTSINS);倒置相差电子显微镜(ZEISS AXIOVERT25);荧光显微镜(NIKON TE2000-U);水浴箱(Fisher Scientific ISOTEMP 210);离心机(SheltonScientific CENTRA CL2);流式细胞仪(BD FACS caliber:BD BIOsciences E97600092)。

1.1.2 试剂与药品:灵芝孢子粉由加拿大energene天然药品有限公司提供，批号为083668。WST-1/ECS溶液为Roche公司产品;RPMI 1640培养基为Fisher Scientific公司产品、新生小牛血清、Hoechst 33258为Invitrogen公司产品;青链霉素(含10 000 U青霉素及10 000微克链霉素)为Invitrogen公司产品，批号为15140-148。台盼兰(Trypan blue)EMD公司产品，批号EM8721-0;Trypsin、碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶A (RnaseA)多聚甲醛溶液(Paraformaldehyde)、为Sigma公司产品;Bax、bcl-2、cleaved-casepase3抗体为cell signaling Technology公司产品;p27Kip1抗体为BD Bioscience产品。抗鼠及抗兔二抗购于Fisher Scientific公司。ECL化学发光试剂盒及感光胶片为GE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞来源及培养:人卵巢癌细胞系OV2008为完成该实验的加拿大york大学生命科学系chun peng实验室保存。用含10%胎牛血清(Sigma公司产品)、1%青霉素链霉素(Invitrogen公司产品)的RPMI 1640培养基(Thermo公司产品)，在37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 灵芝孢子粉工作液配制:灵芝孢子粉由加拿大energene天然药品有限公司提供。将灵芝孢子粉500 mg溶于10 ml DD-H2O中配制成50 mg/ml的灵芝孢子液，高温灭菌、促溶，静置或离心后取上清，用0.20 μm微孔滤膜过滤器过滤除菌，即刻用于实验或作为储存液密封置于4℃冰箱，保存2周，再次使用前70℃孵育10 min。

1.2.3 WST-1法检测灵芝孢子粉对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用:取对数生长期的OV2008细胞，0.2% Trypsin消化后，以每孔4 000个细胞接种于96孔培养板，培养过夜后试验组分别加入浓度为0.1、0.5、1、2、2.5 mg/ml的灵芝孢子液，每个浓度设5个复孔，对照组5个孔同时更换培养液，分别于24、48 h进行比色检测细胞活力。按照试剂盒说明书于每一时间点每孔中加入10 μl WST-1/ECS溶液，培养箱培养30 min，充分振荡1 min，酶标仪测定波长为450 nmOD值，计算药物对细胞生长的抑制率，细胞抑制率=1-试验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。IC50用Logit法计算。

1.2.4 细胞计数法检测灵芝孢子对人卵巢癌细胞生长抑制作用:OV20008细胞消化后以每孔10×104个细胞接种于12孔培养板，培养过夜后试验组分别加入浓度为0.1、0.5、1、2 mg/ml的灵芝孢子液，每个浓度设3个复孔，对照组3个孔加入不含药物的培养液。48 h显微镜下拍照各组细胞形态，之后收获细胞，消化细胞后以1∶1比例与台盼兰混合，光学显微镜下死亡细胞被染成蓝色，而存活细胞因有完整细胞膜存在不被染色，镜下用细胞计数器计数未染色的活细胞数目。

1.2.5 流式细胞技术测定卵巢癌细胞细胞周期分布:取对数生长期的卵巢癌细胞系OV2008，消化后接种100×104个细胞于6 cm细胞培养板，培养过夜后实验组吸去原培养液，分别置入终浓度为0.5、1、2 mg/ml的灵芝孢子粉溶液，对照组加入不含药物的培养液，培养24、48和72 h，收集细胞。0.2%Trypsin消化后离心，弃去上清液，1×PBS 5 ml洗涤后以70%冷乙醇固定，冰上放置30 min后直接上机测定或保存于-20℃冰箱待测。上机前离心弃去冰乙醇，PBS洗2次后以预染溶液(0.2%Triton-100、1 mmol/L EDTA)洗涤一次，加50 μg/ml核糖核酸酶A(RnaseA)及50 μg/ml碘化丙啶(PI)，避光染色60 min，经200目尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定，计算出细胞周期分布情况。

1.2.6 Hoechst-33258染色方法评估细胞凋亡:采用Hoechst-33258染色方法评估细胞凋亡，接种50×104个细胞于6 cm细胞培养板，培养过夜后，以不同浓度灵芝孢子处理细胞，48 h后对照组和实验组细胞分别吸掉培养液，以4%的多聚甲醛溶液(用1×PBS配制)固定细胞20 min，1×PBS洗涤后以1 μg/ml的Hoechst-33258染色15 min，1×PBS洗涤2次，荧光显微镜(NIKON ECLIPSE TE 2000-U)下通过紫外光观察细胞核的改变。

1.2.7 Western blot方法测定bcl-2和Bax，cleavedcaspase3，P27蛋白表达:人卵巢癌细胞OV2008以每孔25×104个细胞数接种于6孔板，次日加入相应剂量的灵芝孢子粉溶液，对照组同时更换培养液，48 h提取总蛋白。细胞用冷PBS洗涤2次，用50 μl Rapa裂解液(radioimmune precipitation assay buffer)裂解细胞，冰上30 min后刮取细胞，以12 000 r/min 4℃离心15 min，收集上清移入新的1.5 ml离心管中，测定蛋白浓度。取20 μg(cleaved casepase-3取50 μg)蛋白样品经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(检测cleaved casepase-3用15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶)90V电压进行电泳分离，之后电转移至硝酸纤维素滤膜(Millipore公司产品)上，用含有50g/L去脂奶粉的TBST (10 mmol/L Tris-Cl(pH值8.0)，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween 20)封闭1 h，分别加入抗bcl-2(1∶1 000)，bax(1∶4 000)，cleaved-caspase-3(1∶500)，P27 (1∶1 000)的抗体(cell signaling Technology公司产品) 4℃反应过夜，T-BST漂洗3次，每次10 min。HRP标记的抗兔IgG二抗孵育1 h;T-BST漂洗3次，应用ECL-plus Western Blot化学发光试剂盒显色检测信号。以β-actin为内参照。

1.3 统计学分析应用Sigmastat 3.5统计软件，计量资料以¯x±表示，采用t检验，两组以上均数比较应用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灵芝孢子抑制卵巢癌细胞增殖WST-1比色法显示，灵芝孢子对卵巢癌OV2008细胞具有明显的生长抑制作用，柱状图显示活性细胞较对照组明显减少，灵芝孢子作用48 h的IC50为(1.30±0.56)mg/ml。采用不同浓度的灵芝孢子处理接种于12孔培养板的OV2008细胞48 h，倒置显微镜下观察到细胞数目随浓度增加而减少，高浓度灵芝孢子组可见细胞脱离培养皿壁成悬浮状态，致贴壁存活细胞数目极少(图2A)。图2B为细胞计数结果，提示随灵芝孢子浓度增加存活细胞数目逐渐减少。见图1、2。

图1 灵芝孢子对人卵巢癌0V2008细胞的增殖抑制作用

图2 灵芝孢子对人卵巢癌OV2008细胞的生长抑制作用。A:不同浓度灵芝孢子处理细胞48 h的显微镜下改变(Hoechst-33258染色×4)。B:药物处理后细胞数目的改变

2.2 灵芝孢子对卵巢癌细胞周期分布的影响本研究应用流式细胞技术检测灵芝孢子作用于卵巢癌细胞后细胞周期的分布，灵芝孢子处理OV2008细胞后多数细胞聚集于G1期，并且G1期细胞数目随作用时间延长而增加。而S期和G2/M期细胞数目较少，且G2/ M细胞随作用时间延长而减少，S期细胞数目随作用时间无明显改变。见图3。

图3 灵芝孢子处理人卵巢癌OV2008细胞不同时间后细胞周期分布情况。A:处理组与对照组细胞周期比率变化，横轴代表处理时间，纵轴代表周期比率;B:流式细胞仪检测药物处理不同时间的细胞周期分布情况

2.3 灵芝孢子诱导卵巢癌细胞凋亡为明确灵芝孢子是否通过凋亡途径致卵巢癌细胞死亡，采用Hoechst-33258染色方法检测卵巢癌细胞凋亡情况。结果显示灵芝孢子可致卵巢癌细胞凋亡，并呈剂量依赖性。荧光显微镜观察到典型凋亡细胞染色后表现为细胞核缩小，染色质浓缩，药物浓度越大凋亡细胞越多。见图4。

图4 不同浓度灵芝孢子处理细胞48 h后细胞凋亡情况(Hoechst-33258染色×4)

2.4 灵芝孢子对卵巢癌细胞相关蛋白的表达灵芝孢子对bcl-2和Bax蛋白表达的影响:为明确灵芝孢子引起卵巢癌细胞凋亡的信号通道，利用灵芝孢子处理后细胞的蛋白质测定了bcl-2和Bax的表达情况。结果表明随灵芝孢子浓度增加bcl-2蛋白表达水平降低，而bax蛋白水平升高灵芝孢子对P 27蛋白表达的影响:为了阐明灵芝孢子对卵巢癌细胞细胞周期影响的机制，采用western blot方法测定了P27的变化。结果显示P27蛋白水平随灵芝孢子浓度增加而增加。灵芝孢子对Casbase-3蛋白表达的影响:为了评估Casbase-3在灵芝孢子引起卵巢癌细胞凋亡中的作用，检测了Casbase-3蛋白在卵巢癌细胞的表达情况。Western blot结果显示35KD的Casbase-3被激活成活化的19、20 kD的cleaved-casepase3，并随灵芝孢子浓度增加表达呈升高趋势。见图5。

图5 不同浓度灵芝孢子处理人卵巢癌OV2008后相关蛋白表达情况

3 讨论

灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的象淡雾状的极其微小的孢子，其主要成分有灵芝多糖、三萜类化合物、生物碱类、多肽及微量元素锌、锗、硒等，有其发挥强大生理功能的重要分子学基础。体内外研究表明灵芝孢子可以抑制多种肿瘤的生长［4-6］。并有实验表明灵芝破壁孢子较完整孢子有更高的生物活性［7］。因此本研究采用破壁的灵芝孢子作为处理因素，用不同浓度的破壁灵芝孢子处理卵巢癌细胞株OV2008不同时间，观察到灵芝孢子可以抑制卵巢癌细胞生长，使细胞生长阻滞于G1期;并能通过上调Bax，caspase-3及下调bcl-2蛋白途径诱导细胞凋亡。

卵巢癌细胞OV2008加入不同浓度的灵芝孢子作用48 h可以观察到细胞生长受到抑制，表现为细胞变圆，部分细胞脱离培养皿呈漂浮状态，这种抑制作用呈剂量依赖性，灵芝孢子浓度的增加，对细胞的增殖抑制作用增强，半数抑制浓度为1.0977 mg/ml。通过DNA特异性结合的荧光染料Hoechst33258染色观察到灵芝孢子作用于卵巢癌细胞后出现典型的凋亡细胞染色质聚集改变。提示灵芝孢子可以通过周期阻滞和诱导凋亡途径发挥增殖抑制作用。

灵芝孢子对肿瘤细胞周期的影响有不同的报道，Zhu等［2］的研究表明灵芝孢子的酒精提取物可以使宫颈癌HeLa细胞停滞于G1/S期，Hu等［8］在乳腺癌MCF-7细胞的研究得到同样的结果。灵芝孢子的水提取物作用于hepatoma细胞可以引起细胞G2/M期捕获［9］。不同的结果可能由于不同的提取方法造成提取物成分有所差异所致［10］。本研究结果提示灵芝孢子作用于OV2008细胞48 h后，可使细胞周期的分布发生明显变化，使停滞于G1期的细胞比例明显增多并随灵芝孢子作用时间而逐渐增加。表明灵芝孢子对OV2008细胞的增殖抑制作用可能与多数肿瘤细胞停滞于G1期，减少了DNA合成和有丝分裂有关。

P27属于CKIs类蛋白，能广泛抑制cyclinD/CDK复合物的活性，使细胞发生G1～S期阻滞，从而对细胞周期发挥负调控作用［11，12］。本研究结果显示灵芝孢子处理OV2008细胞后P27蛋白表达水平随灵芝孢子浓度增加而逐渐升高，与细胞周期的变化相一致。推测灵芝孢子通过P27调控细胞周期。

抑制肿瘤的重要途径之一是诱导凋亡，bcl-2家族中的bcl-2和Bax是调控凋亡的重要基因，细胞中bcl-2可以抑制细胞凋亡，而bax可以促进凋亡［13］，它可以与自身或bcl-2形成二聚体，从而抑制bcl-2活性，促进细胞凋亡发生［14］。P27可以通过调控细胞周期而诱导细胞凋亡［15］。本研究中卵巢癌细胞经灵芝孢子处理后Bax、P27蛋白表达水平升高而bcl-2、bcl-xl表达水平下降，可能是引起细胞凋亡的机制之一。

Casepase家族是凋亡过程中的效应蛋白，活化的casepase-3能通过蛋白酶的水解进行细胞内信号的转导。其中casepase-3是casepase家族中最重要的凋亡执行者，广泛分布于各种类型的细胞中。Casepase-3在细胞中是以无活性的酶原(32 kD)形式存在，活化的Casepase-3(17 kD和19 kD)能促进凋亡信号的转导。研究表明，细胞凋亡信号转导的关键是凋亡下游蛋白casepase-3的激活，裂解相应的胞浆胞核底物最终导致细胞凋亡［16］。灵芝孢子处理OV2008细胞48 h可产生活化的Casepase-3，并且其表达水平随灵芝孢子浓度增大而升高，因而灵芝孢子可能通过casepase-3的信号途径诱导凋亡的发生，从而发挥抑瘤效应。与Ibrado等［17］研究的抑瘤效应机制相一致。

综上所述，体外实验表明灵芝孢子可以抑制卵巢癌OV2008细胞的增殖并诱导其凋亡，其诱导凋亡的机制可能与Bax、P27的高表达、bcl-2、bcl-xl的低表达、激活卵巢癌细胞中Caspase-3的表达以及阻滞细胞周期有关。可以为灵芝孢子作为卵巢癌的辅助治疗提供理论依据。

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Experimental study on the effect of GLSP on human ovarian cancer cell proliferation and apoptosis in vitro

WANG

Weixiao*，YAO Miaomiao，LV Yanru，et al．*Department of Obstetrics and Gynecology，Gaocheng People’s Hospital，Hebei，Gaocheng 052160，China

ObjectiveTo investigate the effect of Ganoderma lucidum spore powder(GLSP)on cell proliferation and apoptosis of human ovarian cell line-OV 2008，and to explore its action mechanism.MethodsThe effects of GLSP on OV2008 cell growth and cell morphous were detected by WST-1 colorimetric technique and microscopy;cell cycle was analyzed flow cytometry;cell apoptosis was detected by Hoechst-33258 staining method;the expression of apoptosis-related proteins(bcl-2 bax，P27，cleaved Caspase-3)were measured by Western blotting.ResultsThe results of WST-1 assays showed that GLSP could inhibit the growth of OV2008 cells，moreover，which was time and dose dependent.The results by flow cytometry showed that GLSP could block OV2008 cell growth at G1 phase.Hoechst 33258 staining results showed that GLSP could induce cell apoptosis.Western blotting results showed that the expression levels of bcl-2，bcl-xl were decreased with the increase of concentration of GLSP，however bax，P27，Caspase-3 could inhibit the growth of ovarian cancer cells and induce cell apoptosis，and its action mechanism was that the expression levels of Casbase-3 that affected cell cycle were gradually increased. ConclusionGLSP can inhibit the growth of ovarian cancer cells，block cell growth at G1 stage，furthermore，which can develop its effects by up-regulating the expression of bax，P27，down-regulating the expression of bcl-2 and activating Caspase-3.

Ganoderma lucidum spore powder;ovarian neoplasms;proliferation;apoptosis;cell cycle

R 737.31

A

1002-7386(2015)02-0165-05

2014-08-19)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．001

项目来源:河北省专家出国培训项目资助(编号:200748)

052160河北省藁城市人民医院妇产科(王卫霄);河北医科大学(姚苗苗、吕艳茹、杜晓欣、张晓静);河北医科大学第二医院妇产科(赵素芬)

赵素芬，050000河北医科大学第二医院妇产科; E-mail:zhaosfchina@hotmail.com