蛋白质瓜氨酸化及其在类风湿关节炎中的意义

钟 兵，方勇飞

(第三军医大学第一附属医院中西医结合科·风湿病专科，重庆 400038)

蛋白质瓜氨酸化及其在类风湿关节炎中的意义

钟 兵，方勇飞

(第三军医大学第一附属医院中西医结合科·风湿病专科，重庆 400038)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的发病机制至今尚未阐明。RA患者体内发现越来越多的抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)提示瓜氨酸化可能参与其发病过程。本文从蛋白质的瓜氨酸化过程、生理功能，ACPA在RA的诊断、预后及发病机制中的作用进行综述，试图更全面地了解蛋白质的瓜氨酸化在RA发病各环节中的作用。

瓜氨酸化；抗瓜氨酸化蛋白抗体；类风湿关节炎；发病机制

瓜氨酸化(citrullination)是指肽酰基或游离的精氨酸在酶的催化下脱掉一个亚胺基，而转化为瓜氨酸的过程。近年来，随着对抗瓜氨酸化的蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的诊断及预后等方面的重要意义有越来越清楚的认识，瓜氨酸化现象得到广泛地关注和研究。目前我们已逐渐认识到，瓜氨酸化是RA的一种普遍现象，并可在其它几种自身免疫性疾病中出现，瓜氨酸化可能参与RA等自身免疫性疾病的发病过程[1]。

1 生理情况下的瓜氨酸化

通常情况下，瓜氨酸化是一种正常的生理过程，参与细胞凋亡、终末期分化、基因调控、生殖发育等多种生理功能。

1.1 瓜氨酸化过程 瓜氨酸化是一种酶促反应，参与瓜氨酸化的酶有许多种，根据其底物的不同，可以分为三类：一类是只能催化游离的精氨酸转化为瓜氨酸的酶。目前已证实的有两种，一种是真核生物体内的一氧化氮合成酶[2]，另一种是细菌中的精氨酸脱亚胺基酶(arginine deiminase)[3]，两者均不需Ca2+的参与。另一类是只能催化肽酰精氨酸的酶。主要是存在于脊椎动物体内的肽酰精氨酸脱亚胺基酶(peptidylarginine deiminase，PAD)，此酶的催化过程需Ca2+的参与[4]。还有一类是目前仅在牙龈卟啉单胞菌中发现的一种酶PPAD(PAD of Porphyromonas gingivalis)，可以在不依赖Ca2+的情况下催化肽酰精氨酸或游离精氨酸转化为瓜氨酸[5]。这种酶与脊椎动物体内的PAD没有进化上的相关性，其氨基酸序列与细菌中发现的精氨酸脱亚胺基酶具有一定的同源性[6]，目前在真核生物体内尚未发现此类酶的存在。瓜氨酸不是蛋白质合成的编码氨基酸，游离精氨酸瓜氨酸化的意义目前尚不清楚，我们通常所谓的瓜氨酸化是指肽酰精氨酸的瓜氨酸化。

Arita等描述了肽酰精氨酸的瓜氨酸化过程[7]。首先，在Ca2+存在的情况下，PAD的半胱氨酸残基结合到精氨酸的胍基上，形成一种四面内旋体的过渡状态，同时释放一个氨。然后利用水分子的亲核性使内旋体分解，重新恢复半胱氨酸残基并形成一个酮基。由此，精氨酸就在酶的作用下转化为瓜氨酸了。

1.2 PAD的表达及功能 目前已在人体内发现5种PAD，分别为PAD1～4和PAD6。人PAD基因位于染色体1p36.1区域，全长共334.7 kb。5种PAD在序列上具有广泛的同源性，不同之处在于其组织分布的不同[4]。

PAD1表达于表皮和子宫，主要作用是催化前丝集蛋白(pro-filaggrin)的瓜氨酸化，促进其成熟，参与角质形成细胞的终末期分化[8，9]。PAD2表达于骨骼肌、大脑、脾、分泌腺等组织和器官，是人体内表达最为广泛的PAD[8]。已知PAD2的底物主要有两种，一是中枢神经系统内的髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)，一是神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。前者的瓜氨酸化可能参与多发性硬化的发病过程[10]，而后者可能与老年性痴呆相关[11]。PAD3表达于表皮和毛囊，其底物为毛透明蛋白(Trichohyalin)，后者是毛囊内根梢的主要结构蛋白[8]。与丝集蛋白一样，毛透明蛋白介导角蛋白丝的聚集，其瓜氨酸化后会打开α螺旋结构，使其在毛囊转谷氨酰胺酶的催化下可以更有效地与角蛋白丝形成交联[12]。PAD4主要表达于人白细胞，也可在大脑、巨噬细胞、胸腺、关节等组织或细胞中检测到，是唯一的表达于细胞核内的PAD[4]。PAD4主要催化组蛋白[13]，后者的瓜氨酸化不但破坏其蛋白结构，而且使其丢失大量正电荷，从而使核小体解聚，DNA容易降解和断裂，最终导致细胞凋亡。PAD6最初是通过序列比对的方式发现的，现已被克隆，主要表达在卵母细胞和胚胎早期[14]，其功能可能与胚胎早期发育有关，目前尚无相关研究结果。

1.3 瓜氨酸化的调节 PAD介导的瓜氨酸化受Ca2+浓度、氨基酸序列等多种因素调节。Ca2+浓度是最关键性的调节因素之一，不同的PAD需要不同的Ca2+浓度[15]。体外实验显示，瓜氨酸化仅在高浓度Ca2+存在的情况下才能进行[16]。生理情况下Ca2+浓度为10-8～10-6M，因此生理情况下所有的PAD均是失活的，这意味着体内的瓜氨酸化只有在特定的情况下才可能发生，如细胞凋亡或表皮细胞终末期分化等所导致的细胞内Ca2+浓度升高。蛋白质的一级结构也可影响瓜氨酸化的效率[17]，如N-Arg-Glu-C序列的瓜氨酸化较慢，而N-Arg-Asp-C序列则较快，靠近N端的精氨酸较少被瓜氨酸化，N-Pro-Arg-Pro-C序列则不会发生瓜氨酸化。蛋白质的二级结构也同样如此，α螺旋难以被瓜氨酸化，而β折叠则最易被瓜氨酸化[18]。此外，最近的一些研究提示瓜氨酸化可能参与基因调控等细胞进程，这提示瓜氨酸化还受到除Ca2+以外的因素调节，从而使其能在生理性Ca2+浓度下发挥活性作用[19]。

1.4 瓜氨酸化对蛋白质的影响 瓜氨酸化可以改变蛋白质的各级结构。体外研究表明，高度的瓜氨酸化可使蛋白质变性，如毛透明蛋白或丝集蛋白中5%的精氨酸残基改变可影响其三级结构，超过10%的精氨酸残基瓜氨酸化则可完全破坏蛋白质结构而使其变性[18]。这可能是因为精氨酸是一种强碱性氨基酸，而瓜氨酸则是一种中性氨基酸，精氨酸被转化为瓜氨酸虽然仅减少了约1 Da的重量，但从蛋白质水平来说，正电荷的丢失则可影响蛋白质的整体电荷、电荷分布、等电点以及氢键、离子键的形成能力，进而影响蛋白质的结构、功能以及蛋白质间的相互作用[18]。

1.5 瓜氨酸化的生理功能 蛋白质的瓜氨酸化具有多种生理功能：①参与细胞的凋亡过程，可能与凋亡时的细胞形态学改变和DNA断裂有关。当细胞发生凋亡时，细胞内Ca2+浓度异常升高，激活PAD。后者可使波形蛋白头区(head domain of vimentin)发生高度瓜氨酸化，导致中间丝网状结构丧失，细胞形态学改变[20]。高浓度的Ca2+可更大程度地激活细胞核内的PAD4，后者广泛地催化组蛋白瓜氨酸化，使核小体解聚，DNA容易发生断裂[13]。②促进细胞终末期分化。表皮细胞死亡前向皮肤表面趋化，在这一过程中，细胞内Ca2+浓度的不断升高逐渐激活PAD1、2或3，作用于角蛋白K1、K10和丝集蛋白等细胞骨架蛋白，这些蛋白质的瓜氨酸化是表皮细胞终末期分化所必须的过程[21]。这一过程也同样见于毛根内鞘细胞中的毛透明蛋白[12]。③调控基因的表达。瓜氨酸化可抑制由17β-雌二醇激活的基因表达。17β-雌二醇可激活具有甲基转移酶功能的辅助激活因子CRAM1(coactivator associated arginine methyl transferase 1)和PRMT1(protein arginine methyl transferase 1)的活性，二者可将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到特定组蛋白的精氨酸残基上(H3：Arg17；H4：Arg3)，这些组蛋白定位于特定基因的启动子区，其甲基化可促进基因的表达，PAD4可通过瓜氨酸化阻断上述过程。研究表明，用17β-雌二醇处理MCF-7细胞后20 min内即可发现甲基化精氨酸明显升高，目的基因诱导表达。40～60 min后局部PAD4可升高两倍，同时伴随甲基化精氨酸的减少，目的基因表达受抑制[18]。④促进卵母细胞和胚胎早期的发育。PAD6可在生殖细胞中表达，动物体内实验显示，PAD6基因失活可导致卵母细胞的细胞骨架分散，雌鼠不孕，而对雄鼠的生育功能没有影响[22]。此外，可在胚胎早期检测到PAD6的表达，提示其功能可能与胚胎早期发育有关[14]。

2 蛋白质的瓜氨酸化与RA

瓜氨酸化蛋白在RA的诊断、预后等方面具有重要意义，新近的研究结果还支持其与RA发病机制的相关性。

2.1 RA中的瓜氨酸化蛋白质的发现 1964年，Nienhuis等报道了一种抗核周因子(antiperinuclear factor，APF)抗体，在不同种族的RA患者中均具有高度的特异性[23]。1979年，Young等发现了另一种RA相关的抗角蛋白抗体(anti-keratin antibody，AKA)[24]。这两种抗体一直被认为是不同的，直到1995年Sebbag等才证实APF 和AKA 的靶抗原均为人类表皮细胞内的丝集蛋白[25]。1998年，Schellekens 等发现瓜氨酸是丝集蛋白抗原决定族的关键成分[26]，从而第一次揭示了瓜氨酸化在RA中的意义。有意思的是，关节内虽然不表达丝集蛋白，但有证据显示关节滑液中可测出AKA，且滴度较血清中高，提示AKA在关节局部分泌[27]。近年来，人们致力于寻找关节内的瓜氨酸化抗原，并相继发现了多种RA特异性瓜氨酸化蛋白及其相关抗体。2001年Masson-Bessiere等证实，瓜氨酸化的纤维蛋白α和β链是RA相关的抗丝集蛋白抗体(AFA)主要的关节内靶点[28]。1994年发现的RA特异性抗Sa抗体，已被证实其靶抗原是瓜氨酸化的波形蛋白[29]。Ⅱ型胶原是关节软骨的主要成分，研究表明Ⅱ型胶原的瓜氨酸化在其打破自身耐受性，成为RA的自身抗原中起重要作用[30]。此外，可能的瓜氨酸化蛋白还包括纤维连接蛋白、α-烯醇化酶、EB病毒核抗原1(EBNA1)和核蛋白[31]。

2.2 ACPA在RA诊断中的意义 APF和AKA是最早发现的RA特异性ACPA，对RA的敏感性分别为49%～94%和36%～59%，特异性为73%～99%和88%～99%[32]。但由于其敏感性较低及检测方法的限制，并未得到广泛的应用和足够的重视。直到2000年，Schellekens 等建立了用人工合成的环瓜氨酸肽(cycled-citrullinated peptide，CCP)检测RA患者anti-CCP的方法后[33]，ACPA在RA诊断中的意义才得到普遍地认可。anti-CCP目前已发展到第三代，对RA的敏感性为75.6%～79.1%，特异性93%～96%，其敏感性较第一代anti-CCP有明显提高，与第二代相当[34，35]。另外，有研究发现RA患者在临床症状出现前即可检测到anti-CCP，且anti-CCP阳性对于未分化关节炎发展为RA有预示作用，提示anti-CCP可能成为RA早期诊断的标志之一[36，37]。抗Sa抗体的靶抗原为瓜氨酸化的波形蛋白，在RA中敏感性为27%～40%，特异性超过95%[38]。另有研究显示，以瓜氨酸化的波形蛋白为底物检测的抗瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体较抗Sa抗体有更高的敏感性，而特异性不变[39]。Nielen等研究发现，抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体(ACF)在RA中的敏感性为55.8%，特异性为92.6%，与anti-CCP相近，并与RA的影像学进展相关[40]。Burkhardt等用瓜氨酸化的Ⅱ型胶原检测RA患者抗瓜氨酸化Ⅱ型胶原抗体阳性率为40.4%[30]。国内进一步研究显示其敏感性为50.3%，特异性90%[41]。Suzuki等检测RA患者抗瓜氨酸化Ⅰ型胶原抗体阳性率与anti-CCP相关，特异性高达99%[42]。

2.3 ACPA对RA预后的意义 ACPA不仅对RA 的诊断具有很高的特异性，并且该类抗体的滴度也与病情严重程度、骨侵蚀的危险性等预后因素相关。anti-CCP阳性者发生骨侵蚀的危险性增加，应用TNF-α拮抗剂治疗后RA 病情改善的同时anti-CCP滴度降低[43]，这些结果均提示anti-CCP与RA的病情进展有关。目前，APF、AKA、抗Sa抗体、ACF等ACPA均已证实与RA的预后相关[38，40，44，45]。另一项研究结果显示，抗MCV抗体比anti-CCP能更好的预示RA的放射学改变[39]。

2.4 蛋白质的瓜氨酸化在RA发病中的作用 ACPA在RA患者中具有高度特异性，可在RA发病之前数年出现，且不断有新的ACPA被发现使ACPA在RA中具有更高的敏感性，这些结果均提示瓜氨酸化蛋白参与了RA 的发病过程。RA主要累及关节滑膜。研究发现，RA患者滑液中anti-CCP是血清中的7.5倍[46]，进一步提示瓜氨酸化蛋白参与了RA的主要病理过程。我们检索了近年有关蛋白质瓜氨酸化与RA的研究文献发现，几乎所有的与RA发病相关的因素均可与蛋白质瓜氨酸化发生联系，并围绕蛋白质的瓜氨酸化、瓜氨酸化蛋白的识别、ACPA的产生发挥作用(见图1)。

图1 多因素介导瓜氨酸化蛋白参与RA发病的机制假设

病毒感染、创伤、炎症等均可诱导正常细胞发生凋亡。细胞凋亡伴随多种自身蛋白的修饰，如泛素化、磷酸化、转谷氨酰胺、瓜氨酸化等，是自身抗原的主要来源方式[47]。细胞凋亡时，细胞内Ca2+浓度升高使PAD激活，催化关节来源的蛋白发生瓜氨酸化，可能是RA发病的始动因素之一。凡是可以影响蛋白瓜氨酸化过程的因素，均可能影响RA的发病。如PAD4基因多态性可影响PAD4基因的表达水平，进而调节蛋白的瓜氨酸化，这可能解释PAD4基因与RA易感的相关性[48]。最近的研究显示，雌激素可通过雌激素受体激活的AP-1、Sp1和NF-Y等转录因子增强PAD4基因的表达[49]，这可能部分解释女性易患RA的原因。病毒感染还可能通过其它方式诱发RA。Pratesi等的研究显示抗瓜氨酸化的EB病毒核抗原-1多肽(CEBNA-1)抗体在RA中的阳性率为50%[50]，提示EB病毒感染可能通过诱导疾病特异性抗体参与RA 的发病。牙龈卟啉单胞菌是一种非酵解糖的革兰氏阴性厌氧球杆菌，是牙周炎的主要致病菌，目前已有研究显示牙周炎与RA相关。该细菌产生的PPAD酶可催化自身及多种蛋白质如波形蛋白、纤维蛋白原、α烯醇酶等发生瓜氨酸化，后者均是RA的特异性自身抗原。进一步研究还发现在RA患者体内可检测到抗瓜氨酸化的PPAD的抗体[51]。这些研究提示龈紫单胞菌通过PPAD催化蛋白质的瓜氨酸化，从而参与RA的发病过程。

有研究在其他炎症性关节炎如骨关节炎等的滑膜中也发现有瓜氨酸化蛋白的存在[52]，却没有anti-CCP的产生，提示蛋白瓜氨酸化可能不是RA特异性的，但针对瓜氨酸化蛋白的免疫反应却是RA所特有的。这些结果表明有其它因素参与自身反应性T细胞对瓜氨酸化蛋白的识别以及B细胞产生ACPA，而这一过程对RA可能更加重要。Hill等的研究发现瓜氨酸化多肽与共享表位HLA-DRB1*0401分子的亲和力升高[53]，进一步的研究提示HLA-DRB1*0401与anti-CCP水平显著相关[54]。Ling等发现共享表位可作为配体与树突状细胞(dendritic cell，DC)表面上的肌钙网蛋白(calreticulin，CRT)结合，进而抑制CD11c+CD8+DC细胞色氨酸加氧酶(indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)的活性及增加CD11c+CD8-DC细胞IL-6的分泌，最终抑制Treg细胞分化及促进Th17细胞分化成熟[55]。并发现在RA患者滑膜组织存在大量的瓜氨酸化的CRT，而CRT的瓜氨酸化可提高与共享表位配体的亲和力[56]。这些研究结果解释了瓜氨酸化、共享表位与RA的关系。此外，吸烟与HLA-DR4阳性RA患者的anti-CCP水平相关，但与HLA-DR4阴性的RA患者不相关[57]，还有研究发现吸烟可升高肺内细胞外PAD2酶的水平，从而促进蛋白质的细胞外瓜氨酸化[58]，提示吸烟可能通过促进蛋白质的瓜氨酸化及HLA-DR4呈递瓜氨酸化多肽的过程两个方面，影响RA的发病。动物实验表明，B细胞凋亡调节缺陷是其产生ACPA的关键性因素[59]，这提示一些细胞因子如SDF-1、BAFF、APRIL、IL-6等，可能通过抑制B细胞凋亡而参与ACPA的调节，从而在RA的发生发展中发挥相应的作用[60]。

对于瓜氨酸化如何导致RA，目前已有部分动物实验结果。2005年，Lundberg等用瓜氨酸化的Ⅱ型胶原免疫大鼠，结果显示胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)的发生率和关节炎评分均高于天然的Ⅱ型胶原，且关节中的瓜氨酸化蛋白和PAD4的表达量与关节的炎症程度呈正相关，而在正常大鼠的关节中则检测不到瓜氨酸化蛋白和PAD4[61]。随后Duplan等分别用自体的瓜氨酸化纤维蛋白原(C-rFBG)和天然的纤维蛋白原(NC-rFBG)免疫大鼠，结果C-rFBG可以使大鼠产生针对C-rFBG的抗体，但不能引起关节炎，而NC-rFBG不能引起大鼠的免疫反应[62]。尽管该结果没有显示C-rFBG与关节炎的相关性，但却从侧面证实了瓜氨酸化可打破自身抗原的免疫耐受。Kuhn等的研究证实，ACPA可增加CIA小鼠的组织损伤，预先用瓜氨酸肽进行免疫耐受可使病情显著减轻[63]。但对ACPA如何参与RA的组织损伤过程目前尚不清楚，其可能的机制是ACPA与瓜氨酸化蛋白形成免疫复合物，进而激活炎症细胞，产生炎症因子，并进一步促进炎症细胞浸润，导致更多的瓜氨酸化蛋白的产生，形成恶性循环，RA缠绵不愈。该免疫复合物也可激活补体，导致组织损伤和炎症反应。最新的一项研究结果显示，补体受体CR2/CR1缺陷小鼠的CIA病情较轻，抗Ⅱ型胶原抗体和ACPA的水平较低[64]，支持补体在RA病理改变中的作用。瓜氨酸化还可能参与RA关节外病变，在类风湿结节和RA间质性肺炎的病理切片中均可发现瓜氨酸化蛋白的存在，阳性率分别为70%和44%[65]。值得注意的是，瓜氨酸化蛋白同样存在于非RA的间质性肺炎中(40%)，该研究结果进一步突出了ACPA在RA中的作用。

3 展望

瓜氨酸化现象的发现为RA的研究提供了新的思路。用瓜氨酸化蛋白免疫小鼠建立的新的动物模型，将可能替代目前常用的CIA、AA等模型，用于RA的发病机制、抗RA药物的药理作用等方面的研究。此外，抑制瓜氨酸化蛋白和ACPA的产生途径，可能成为RA治疗的新靶点。

[1] Valesini G，Gerardi MC，Iannuccelli C，et al.Citrullination and autoimmunity[J].Autoimmun Rev，2015，1 4(6)：490-497.

[2] Keilhoff G，Wolf G.Citrulline immunohistochemistry may not necessarily identify nitric oxide synthase activity：the pitfall of peptidylarginine deiminase[J].Nitric Oxide，2003，8(1)：31-38.

[3] Wei Y，Zhou H，Sun Y，et al.Insight into the catalytic mechanism of arginine deiminase：functional studies on the crucial sites[J].Proteins，2007，66(3)：740-750.

[4] Vossenaar ER，Zendman AJ，van Venrooij WJ，et al.PAD，a growing family of citrullinating enzymes：genes，features and involvement in disease[J].Bioessays，2003，25(11)：1106-1118.

[5] McGraw WT，Potempa J，Farley D，et al.Purification，characterization，and sequence analysis of a potential virulence factor from Porphyromonas gingivalis，peptidylarginine deiminase[J].Infect Immun，1999，67(7)：3248-3256.

[6] Shirai H，Blundell TL，Mizuguchi K.A novel superfamily of enzymes that catalyze the modification of guanidino groups[J].Trends Biochem Sci，2001，26(8)：465-468.

[7] Arita K，Hashimoto H，Shimizu T，et al[J].Structural basis for Ca(2+)-induced activation of human PAD4[J].Nat，Struct，Mol Biol，2004，11(8)：777-783.

[8] Terakawa H，Takahara H，Sugawara K.Three types of mouse peptidylarginine deiminase：characterization and tissue distribution[J].J Biochem Tokyo，1991，110(4)：661-666.

[9] Ishida-Yamamoto A，Senshu T，Eady RA，et al.Sequential reorganization of cornified cell keratin filaments involving filaggrin-mediated compaction and keratin 1 deimination[J].J Invest Dermatol，2002，118(2)：282-287.

[10]Moscarello MA，Wood DD，Ackerley C，et al.Myelin in multiple sclerosis is developmentally immature[J].J Clin Invest，1994，94(1)：146-154.

[11]Ishigami A，Ohsawa T，Hiratsuka M，et al.Abnormal accumulation of citrullinated proteins catalyzed by peptidylarginine deiminase in hippocampal extracts from patients with Alzheimer’s disease[J].J Neurosci Res，2005，80(1)：120-128.

[12]Tarcsa E，Marekov LN，Andreoli J，et al.The fate of trichohyalin.Sequential post-translational modifications by peptidyl-arginine deiminase and transglutaminases[J].J Biol Chem，1997，272(44)：27893-27901.

[13]Nakashima K，Hagiwara T，Yamada M.Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes[J].J Biol Chem，2002，277(51)：49562-49568.

[14]Wright PW，Bolling LC，Calvert ME，et al.ePAD，an oocyte and early embryo-abundant peptidylarginine deiminase-like protein that localizes to egg cytoplasmic sheets[J].Dev Biol，2003，256(1)：74-89.

[15]Méchin MC，Enji M，Nachat R，et al.The peptidylarginine deiminases expressed in human epidermis differ in their substrate specificities and subcellular locations[J].Cell Mol，Life Sci，2005，62(17)：1984-1995.

[16]Takahara H，Okamoto H，Sugawara K.Calcium-dependent properties of peptidylarginine deiminase from rabbit skeletal muscle[J].Agric Biol Chem，1986，50(11)：2899-2904.

[17]Nomura K.Specificity and mode of action of the muscle-type protein-arginine deiminase[J].Arch Biochem Biophys，1992，293(2)：362-369.

[18]Tarcsa E，Marekov LN，Mei G，et al.Protein unfolding by peptidylarginine deiminase.Substrate specificity and structural relationships of the natural substrates trichohyalin and filaggrin[J].J Biol Chem，1996，271(48)：30709-30716.

[19]Wang Y，Wysocka J，Sayegh J，et al.Human PAD4 regulates histone arginine methylation levels via demethylimination[J].Science，2004，306(5694)：279-283.

[20]Asaga H，Yamada M，Senshu T.Selective deimination of vimentin in calcium ionophore-induced apoptosis of mouse peritoneal macrophages[J].Biochem Biophys Res Commun，1998，243(3)：641-646.

[21]György B，Tóth E，Tarcsa E，et al.Citrullination：a posttranslational modification in health and disease[J].Int J Biochem Cell Biol，2006，38(10)：1662-1677.

[22]Esposito G，Vitale AM，Leijten FP，et al.Peptidylarginine deiminase(PAD)6 is essential for oocyte cytoskeletal sheet formation and female fertility[J].Mol Cell Endocrinol，2007，273(1-2)：25-31.

[23]Nienhuis RLF，Mandena EA.A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis：the antiperinuclear factor[J].Ann Rheum Dis，1964，23：302-305.

[24]Young BJ，Mallya RK，Leslie RD，et al.Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis[J].Br Med J，1979，2(6182)：97-99.

[25]Sebbag M，Simon M，Vincent C，et al.The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies[J].J Clin Invest，1995，95(6)：2672-2679.

[26]Schellekens GA，de Jong BA，van den Hoogen FH，et al.Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies[J].J Clin Invest，1998，101(1)：273-281.

[27]Kirstein H，Hjarvard K，Hansen TM.Antikeratin antibodies in synovial fluid in rheumatoid arthritis[J].APMIS，1989，97(2)：185-189.

[28]Masson-Bessière C，Sebbag M，Girbal-Neuhauser E，et al.The major synovial targets of the rheumatoid arthritis-specific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the α and β chains of fibrin[J].J Immunol，2001，166：4177-4184.

[29]Vossenaar ER，Després N，Lapointe E，et al.Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target citrullinated vimentin[J].Arthritis Res Ther，2004，6(2)：R142-150.

[30]Burkhardt H，Sehnert B，Bockermann R，et al.Humoral immune response to citrullinated collagen type II determinants in early rheumatoid arthritis[J].Eur J Immunol，2005，35(5)：1643-1652.

[31]Cantaert T，De Rycke L，Bongartz T，et al.Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis：crucial but not sufficient! Arthritis Rheum，2006，54(11)：3381-3389.

[32]Alnigenis MN，Warikoo S，Barland P.Antiperinuclear factor and antikeratin antibody：diagnostic use in a clinical laboratory setting.J Rheumatol，2000，27(8)：2056-2057.

[33]Schellekens GA，Visser H，de Jong BA，et al.The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide[J].Arthritis Rheum，2000，43(1)：155-163.

[34]Santiago M，Baron M，Miyachi K，et al.A comparison of the frequency of antibodies to cyclic citrullinated peptides using a third generation anti-CCP assay(CCP3)in systemic sclerosis，primary biliary cirrhosis and rheumatoid arthritis[J].Clin Rheumatol，2008，27(1)：77-83.

[35]Wu R，Shovman O，Zhang Y，et al.Increased prevalence of anti-third generation cyclic citrullinated peptide antibodies in patients with rheumatoid arthritis and CREST syndrome[J].Clin Rev Allergy Immunol，2007，32(1)：47-56.

[36]Nielen MM，van Schaardenburg D，Reesink HW，et al.Specific autoantibodies precede the symotoms of rheumatoid arthritis：a study of serial measurements in blood donors[J].Arthritis Rheum，2004，50(2)：380-386.

[37]Van Gaalen FA，Linn-Rasker SP.Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis：a prospective cohort study[J].Arthritis Rheum，2004，50(3)：709-715.

[38]El-Gabalawy HS，Wilkins JA.Anti-Sa antibodies：prognostic and pathogenetic significance to rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther，2004，6(2)：86-89.

[39]Mathsson L，Mullazehi M，Wick MC，et al.Antibodies against citrullinated vimentin in rheumatoid arthritis：higher sensitivity and extended prognostic value concerning future radiographic progression as compared with antibodies against cyclic citrullinated peptides[J].Arthritis Rheum，2008，58(1)：36-45.

[40]Nielen MM，van der Horst AR，van Schaardenburg D，et al.Antibodies to citrullinatod human tibrinogen(ACF)have diagnostic and prognostic value in early arthritis[J].Ann Rheum Dis，2005，64(8)：1199-1204.

[41]田昕，毕黎琦，栗占国.抗瓜氨酸化Ⅱ型胶原抗体的检测及其与类风湿关节炎的相关性研究[J].中华医学杂志，2006，86(33)：2334.

[42]Suzuki A，Yamada R，Ohtake-Yamanaka M，et al.Anti-citrullinated collagen type I antibody is a target of autoimmunity in rheumatoid arthritis[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，333(2)：418-426.

[43]Niewold TB，Harrison MJ，Paget SA.Anti-CCP antibody testing as a diagnostic and prognostic tool in rheumatoid arthritis[J].QJM，2007，100(4)：193-201.

[44]Meyer O，Labarre C，Dougados M，et al.Anticitrullinated protein/peptide antibody assays in early rheumatoid arthritis for predicting five year radiographic damage[J].Ann Rheum Dis，2003，62(2)：120-126.

[45]Agrawal S，Misra R，Aggarwal A.Autoantibodies in rheumatoid arthritis：association with severity of disease in established RA[J].Clin Rheumatol，2007，26(2)：201-204.

[46]Masson-Bessière C，Sebbag M，Durieux JJ，et al.In the rheumatoid pannus，antifilaggrin autoantibodies are produced by local plasma cells and constitute a higher proportion of IgG than in synovial fluid and serum[J].Clin Exp Immunol，2000，119：544-552.

[47]Utz PJ，Gensler TJ，Anderson P.Death，autoantigen modifications，and tolerance[J].Arthritis Res，2000，2(2)：101-114.

[48]Suzuki A，Yamada R，Chang X，et al.Functional haplotypes of PADI4，encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4，are associated with rheumatoid arthritis[J].Nat Genet，2003，34(4)：395-402.

[49]Dong S，Zhang Z，Takahara H.Estrogen-Enhanced Peptidylarginine Deiminase Type IV Gene(PADI4)Expression in MCF-7 Cells Is Mediated by Estrogen Receptor-alpha-Promoted Transfactors Activator Protein-1，Nuclear Factor-Y，and Sp1[J].Mol Endocrinol，2007 Jul，21(7)：1617-1629.

[50]Pratesi F，Tommasi C，Anzilotti C，et al.Deiminated Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 is a target of anti-citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2006，54(3)：733-741.

[51]Quirke AM1，Lugli EB，Wegner N，et al.Heightened immune response to autocitrullinated Porphyromonas gingivalis peptidylarginine deiminase：a potential mechanism for breaching immunologic tolerance in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2014，73(1)：263-269.

[52]Vossenaar ER，Smeets TJ，Kraan MC，et al.The presence of citrullinated proteins is not specific for rheumatoid synovial tissue[J].Arthritis Rheum，2004，50(11)：3485-3494.

[53]Hill JA，Southwood S，Sette A，et al.Cutting edge：the conversion of arginine to citrulline allows for a high-affinity peptide interaction with the rheumatoid arthritis-associated HLA-DRB1*0401 MHC class Ⅱ molecule[J].J Immunol，2003，171(2)：538-541.

[54]Irigoyen P，Lee AT，Wener MH，et al.Regulation of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in rheumatoid arthritis：contrasting effects of HLA-DR3 and the shared epitope alleles[J].Arthritis Rheum，2005，52(12)：3813-3818.

[55]Ling S，Cline EN，Haug TS，et al.Citrullinated calreticulin potentiates rheumatoid arthritis shared epitope signaling[J].Arthritis Rheum，2013，65(3)：618-626.

[56]De Almeida DE1，Ling S，Pi X，et al.Immune dysregulation by the rheumatoid arthritis shared epitope[J].J Immunol，2010，185(3)：1927-1934.

[57]van der Helm-van Mil AH，Verpoort KN，le Cessie S，et al.The HLA-DRB1 shared epitope alleles differ in the interaction with smoking and predisposition to antibodies to cyclic citrullinated peptide[J].Arthritis Rheum，2007，56(2)：425-432.

[58]Damgaard D，Friberg Bruun Nielsen M，Quisgaard Gaunsbaek M，et al.Smoking is associated with increased levels of extracellular peptidylarginine deiminase 2(PAD2)in the lungs[J].Clin Exp Rheumatol，2015，33(3)：405-408.

[59]López-Hoyos M，Marquina R，Tamayo E，et al.Defects in the regulation of B cell apoptosis are required for the production of citrullinated peptide autoantibodies in mice[J].Arthritis Rheum，2003，48(8)：2353-2361.

[60]Silverman GJ，Khanna S.B cell modulation in rheumatology[J].Curr Opin Pharmacol，2007，7(4)：426-433.

[61]Lundberg K，Nijenhuis S，Vossenaar ER，et al.Citrullinated proteins have increased immunogenicity and arthritogenicity and their presence in arthritic joints correlates with disease severity[J].Arthritis Res Ther，2005，7(3)：R458-467.

[62]Duplan V，Foulquier C，Clavel C.In the rat，citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune response is not arthritogenic[J].Clin Exp Immunol，2006，145(3)：502-512.

[63]Kuhn KA，Kulik L，Tomooka B，et al.Antibodies against citrullinated proteins enhance tissue injury in experimental autoimmune arthritis[J].J Clin Invest，2006，116(4)：961-973.

[64]Kuhn KA，Cozine CL，Tomooka B，et al.Complement receptor CR2/CR1 deficiency protects mice from collagen-induced arthritis and associates with reduced autoantibodies to type II collagen and citrullinated antigens[J].Mol Immunol，2008.03.27 [Epub ahead of print]

[65]Bongartz T，Cantaert T，Atkins SR，et al.Citrullination in extra-articular manifestations of rheumatoid arthritis[J].Rheumatology(Oxford)，2007，46(1)：70-75.

The role of citrullinated proteins in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

ZHONG Bing，FANG Yong-fei

(Department of Rheumatology and Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

FANGYong-fei

The mechanism of rheumatoid arthritis(RA)has not been clarified.More and more anti-citrullinated protein antibodies(ACPA)have been found in RA patients，suggesting that citrullinated proteins may be involved in the pathogenesis of RA.This paper reviews the process of protein citrullination，physiological function and the role of ACPA in the diagnosis，prognosis and pathogenesis of RA in order to get a more comprehensive understanding of the role of citrullinated proteins in the pathogenesis of RA.

Citrullination； Anti-citrullinated protein antibody； Rheumatoid arthritis； Pathogenesis

方勇飞，男，主任医师，教授，博士研究生导师。中华医学会风湿病分会委员，中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员，中华中医药学会风湿病分会常务委员，重庆市医学会风湿病专业委员会主任委员。主要研究方向：感染与免疫在类风湿关节炎发病机制中的作用。

R593.22

A

1672-6170(2015)05-0032-07

2015-07-15)